• 中文核心期刊
  • CSCD来源期刊
  • 中国科技核心期刊
  • CA、CABI、ZR收录期刊

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

新型鸭呼肠孤病毒病浓缩灭活疫苗的制备及免疫原性分析

陈仕龙 肖世峰 程晓霞 林锋强 王劭 王锦祥 朱小丽 陈少莺

引用本文:
Citation:

新型鸭呼肠孤病毒病浓缩灭活疫苗的制备及免疫原性分析

    作者简介: 陈仕龙(1979-), 男, 博士, 副研究员, 主要从事动物病毒病研究
    通讯作者: 陈少莺(1962-), 女, 硕士, 研究员, 主要从事动物传染病病原与防治研究(E-mail:chensy58@163.com)
  • 基金项目:

    福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2014R1023-9);福建省农业科学院青年英才项目(YC2016-1)

  • 中图分类号: S858

Efficacy Evaluation of a Concentrated Inactivated Vaccine against Novel Duckling Reovirus Infection

图(2) / 表(1)
计量
  • 文章访问数:  316
  • HTML全文浏览量:  55
  • PDF下载量:  82
  • 被引次数: 0
出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2017-07-15
  • 修改稿:  2017-09-20

新型鸭呼肠孤病毒病浓缩灭活疫苗的制备及免疫原性分析

    通讯作者: 陈少莺, chensy58@163.com
    作者简介: 陈仕龙(1979-), 男, 博士, 副研究员, 主要从事动物病毒病研究
  • 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心, 福建 福州 350013
基金项目:  福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项 2014R1023-9福建省农业科学院青年英才项目 YC2016-1

摘要: 为研制高效的新型鸭呼肠孤病毒病(NDRV)灭活疫苗,分别采用病毒尿囊液和浓缩后病毒尿囊液为抗原,经甲醛灭活处理后与常规油佐剂制成灭活疫苗,并进行种鸭免疫后血清学检测、雏鸭免疫保护及安全试验。结果表明,浓缩疫苗安全性好,能明显提高疫苗的免疫效果,高峰期抗体效价的免疫持续期比常规疫苗长;浓缩疫苗免疫雏鸭后的免疫保护性达100%。以上研究表明,NDRV浓缩疫苗安全、高效,在雏鸭上具有良好的免疫保护效果,具有良好的市场前景。

English Abstract

  • 新型鸭呼肠孤病毒病(俗称鸭出血性坏死性肝炎,NDRV)是2005年以来在我国多品种鸭群中流行的一种新传染病。该病发病日龄小(5~10日龄),发病率5%~20%、死亡率2%~15%,剖检以肝脾出血、坏死为特征性[1-3]。本课题组在前期的研究中已经研制出安全、有效的油乳剂灭活疫苗,种鸭经2次免疫后能产生良好的中和抗体[4]。为了进一步优化NDRV灭活疫苗的质量,本研究采用物理浓缩后的NDRV抗原制备成灭活疫苗,并与未浓缩的常规NDRV灭活疫苗进行比较,分析浓缩抗原疫苗的免疫原性。

    • 新型鸭呼肠孤病毒弱毒株(NDRV JM85)和强毒株(NDRV NP03)由本实验室分离、鉴定、保存;对漳州某养殖场鸭群NDRV抗体进行检测,挑选无母源抗体的10日龄樱桃谷鸭胚,3日龄樱桃谷鸭和半番鸭,临近产蛋、NDRV抗体为阴性的樱桃谷鸭用于本试验。

    • 将JM85病毒株接种10日龄的樱桃谷鸭胚,收获24 h后死亡鸭胚的尿囊液病毒,经3 000 r·min-1离心15 min,弃掉沉淀物,上清液装入透析袋中,扎紧透析袋两端,放入PEG20000盐粉中,4℃进行透析,当透析浓缩至原总体积的1/5时取出,用少量的灭菌PBS冲洗透析袋内壁,至浓缩后终体积为病毒原液的1/4。收取浓缩前后的尿囊液,在10日龄樱桃谷鸭胚中测定ELD50

    • 分别将浓缩后尿囊液及未浓缩的尿囊液加入终浓度为0.15%甲醛溶液,37℃灭活24 h,每隔8 h充分混匀1次。灭活后病毒原液按照文献[4]的方法,按油相、水相比例为3:2进行搅拌混匀,制成油包水型灭活疫苗。

    • 3日龄健康雏樱桃谷鸭各15羽,每羽颈部皮下及肌肉各注射1.0 mL的浓缩抗原疫苗或未浓缩的常规疫苗,每日观察鸭群精神和健康状况,连续观察20 d,并在接种后5 d随机剖杀5羽·组-1,观察肝、脾等内脏病变。

    • 取上述两种灭活疫苗接种临近产蛋的樱桃谷鸭,1.0 mL·羽-1,20羽·组-1;取免疫鸭和对照鸭,在免疫后第2、3、5、7、9、11、13周采血,参考文献[5-6],采用固定病毒稀释血清法,测定血清的中和抗体效价,操作简述如下:在96孔板中培养鸭胚成纤维细胞,细胞单层后,待测血清用无血清的DMEM培养液进行2倍比稀释,取各稀释度血清与等体积的200TCID50的病毒液混匀,37℃作用60 min后,取混合液接种鸭胚成纤维细胞,20 μL·孔-1,每个稀释度重复4孔,同时设病毒对照孔和阴性对照孔,置37℃、5% CO2培养箱中培养,每日观察细胞病变,按Reed-Muench方法计算血清中和抗体效价。

    • 3日龄半番鸭和樱桃谷鸭接种疫苗,0.3 mL·羽-1,15羽·组-1,同时设未免疫的对照鸭;免疫后7 d各组鸭接种NDRV强毒NDRV NP03,1.0 mL·羽-1;攻毒后5 d,每组随机取5羽称重后剖杀,观察肝脾等内脏病变;另10羽继续观察20 d。体重数据以平均值±SD表示,并采用t检验计算统计学差异。

    • 病毒接种鸭胚,收集的鸭胚尿囊液病毒在10日龄樱桃谷鸭胚中测定的ELD50为10-5.0·(0.1 mL)-1,经透析浓缩后尿囊液病毒对10日龄樱桃谷鸭胚的ELD50达10-5.8·(0.1 mL)-1

    • 取浓缩和未浓缩的尿囊液病毒用甲醛灭活后,参考文献[4]的方法制成2种油佐剂灭活疫苗。将这2种油佐剂疫苗大剂量接种3日龄樱桃谷鸭,结果显示雏鸭接种后在整个观察期内的采食、饮水、精神状态等均正常,未见发病和死亡;接种后5 d每组随机剖杀5羽,肝、脾等内脏器官未见异常,表明灭活疫苗安全性好。

    • 常规疫苗1次免疫成年樱桃谷鸭后,第2周开始产生中和抗体并渐进上升,7周时效价达到最高值,至9周时抗体效价趋于稳定,随后开始逐渐下降。浓缩疫苗1次免疫成年樱桃谷鸭后,第2周开始产生中和抗体并迅速上升,5周时效价达到顶峰,并维持高效价至9周,之后开始逐渐下降。对照组在各个时间点仅有轻微的中和抗体背景值(图 1)。以上结果表明浓缩疫苗接种后所诱导的中和抗体效价明显高于未浓缩的常规灭活疫苗,且抗体效价高峰期的维持时间比常规疫苗长。

      图  1  成年樱桃谷鸭1次免疫后血清中和抗体效价

      Figure 1.  Serum neutralizing antibody titers of adult Cherry Valley ducks immunized with one single-dose of inactived vaccines

    • 雏半番鸭和樱桃谷鸭免疫浓缩疫苗后攻击NDRV强毒,在整个观察期间免疫攻毒组鸭群均未见发病,与健康对照鸭类似,剖杀也未见半番鸭/樱桃谷鸭的肝、脾等内脏器官均正常,未见出血、坏死等特征病变。免疫常规疫苗的雏半番鸭和樱桃谷鸭攻击NDRV强毒,攻毒后虽然未见明显临床症状,但是免疫攻毒鸭的肝、脾可见少量坏死灶,半番鸭和樱桃谷鸭的病变率分别达60%和40%;攻毒对照组在攻击强毒后第3天开始发病,表现为羽毛脏乱,吃料、饮水下降,不愿走动,剖检见肝、脾大量的坏死灶,脾脏肿大(表 1图 2)。上述结果表明浓缩疫苗1次免疫后7 d攻毒,具有良好的预防保护效果;而未浓缩的常规疫苗1次免疫后攻毒,也能明显减少由强毒感染造成的内脏病变,但保护效果比浓缩疫苗差。

      表 1  雏鸭免疫后的攻毒保护试验

      Table 1.  Protective efficacy test on ducklings immunized with inactivated vaccines

      组别 雏半番鸭 雏樱桃谷鸭
      肝、脾出现病变的羽数 发病率/% 死亡率/% 平均体重/g 肝、脾出现病变的羽数 发病率/% 死亡率/% 平均体重/g
      浓缩疫苗免疫攻毒组 0 0 0 413.33±9.85 0 0 0 497.5±9.2
      常规疫苗免疫攻毒组 3 60 0 379.0±23.9* 2 40 0 455.33±11.3**
      攻毒对照组 5 100 0 349.5±10.7** 5 100 0 426.17±11.0**
      空白对照组 0 0 0 411.5±9.4 0 0 0 501.67±14.1
      注:*表示与同日龄的对照组相比差异显著(P < 0.05),**表示与同日龄的对照组相比差异极显著(P < 0.01)。

      图  2  雏鸭免疫后攻毒肝脏的剖检病变

      Figure 2.  Necropsy lesions in livers of ducklings inoculated with NDRV at 7 days post-vaccination

    • 灭活疫苗中的抗原由于经过灭活处理,接种后不能在体内增殖,所以疫苗诱导机体产生的免疫应答强度与抗原含量及免疫原性密切相关[7]。前期研制的常规灭活疫苗需2次免疫后才能产生有效的中和抗体,限制了其在雏鸭中的应用。为了进一步优化NDRV灭活疫苗的质量,本研究采用透析袋浓缩的方法增加抗原含量,研制浓缩疫苗,比较浓缩疫苗与常规疫苗的免疫原性。发现浓缩疫苗安全性好,能明显提高疫苗的免疫保护效果,高峰期抗体效价比常规疫苗显著增高,且高峰期抗体的免疫持续期比常规疫苗长,浓缩疫苗免疫1次就能达到常规疫苗2次免疫的效果;雏鸭免疫浓缩疫苗后,其免疫后7 d的攻毒保护率为100%,而常规疫苗免疫后7 d的攻毒保护率仅为40%~60%;浓缩疫苗免疫攻毒鸭的体重与正常对照鸭体重无差异,但显著高于攻毒对照鸭和常规疫苗免疫攻毒鸭,表明研制的浓缩疫苗安全、高效,种鸭只需1次免疫就能诱导强的免疫应答,同时疫苗也能够应用于雏鸭,具有良好的市场前景,也为研制不同疾病的多联疫苗奠定了基础。

      NDRV的典型临床特征是感染鸭的肝脏、脾脏出现明显的坏死灶。部分感染鸭虽然未能观察到临床症状,但是已经隐性感染,肝、脾已经有坏死灶。所以本研究在分析疫苗的免疫保护效力时,采用免疫攻毒后剖杀的方法,观察肝、脾内脏出现病变的阳性率和病变程度,为疫苗质量评价提供了一种安全、便捷、准确的方法。常规疫苗免疫雏鸭攻毒后,其肝脏、脾脏的病变程度明显低于攻毒对照鸭,而浓缩疫苗免疫攻毒后,肝、脾均未见异常,免疫鸭的精神、采食、生长状况也均正常。这些结果证实NDRV灭活疫苗具有良好的免疫原性,且免疫效果与抗原含量成正比;也进一步表明,浓缩疫苗适合用于雏鸭,雏鸭1~3日龄免疫,免疫后7 d就可以抵抗强毒的感染,使雏鸭度过该病的危险窗口期。

      本研究虽然建立了一种通过观察免疫攻毒鸭肝、脾内脏病变程度来评价疫苗免疫效力的方法,但是内脏器官组织结构是否发生病理变化还需要通过病理切片进一步观察,这部分研究正在进行,将另文报道。

参考文献 (7)

目录

    /

    返回文章
    返回