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鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的原核表达

万春和 程龙飞 陈红梅 傅光华 傅秋玲 施少华 陈翠腾 刘荣昌 黄瑜

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鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的原核表达

    作者简介: 万春和 (1982-), 男, 博士, 助理研究员, 主要从事水禽病原分子生物学研究 (E-mail: chunhewan@126.com)
    通讯作者: 黄瑜 (1965-), 男, 博士, 研究员, 主要从事畜禽传染病学研究 (E-mail: huangyu_815@163.com)
  • 基金项目:

    国家水禽产业体系项目(CARS-43);福建省畜禽疫病防控技术重大研发平台(2014N2003);福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”专项(YC2015-12);福建省优良蛋鸭品种与设施化养殖创新产业化工程项目(2014-2016)

  • 中图分类号: S852

Prokaryotic Expression of RaDtxR Gene of Riemerella anatipestifer

  • 摘要: 本研究根据前期研究获得的鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,并在引物上下游引入BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-RaDtxR,对其进行IPTG诱导表达条件优化和表达目的蛋白的生物学活性鉴定。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,分子量约为51 ku目的蛋白得到表达,并具有良好的生物学活性。本研究成功对鸭疫里默氏菌RaDtxR基因进行表达,为研究鸭疫里默氏菌RaDtxR蛋白生物学功能奠定基础。
  • 图 1  RaDtxR基因的PCR扩增

    Fig. 1  PCR amplification of RaDtxR gene

    图 2  重组质粒的双酶切鉴定

    Fig. 2  Double digestion analysis on recombinant plasmids

    图 3  表达蛋白的SDS-PAGE分析

    Fig. 3  SDS-PAGE analysis on expressed proteins

    图 4  表达蛋白的western blot分析

    Fig. 4  Western blot analysis on expressed proteins

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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2016-06-28
  • 修改稿:  2016-09-14

鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因的原核表达

    通讯作者: 黄瑜, huangyu_815@163.com
    作者简介: 万春和 (1982-), 男, 博士, 助理研究员, 主要从事水禽病原分子生物学研究 (E-mail: chunhewan@126.com)
  • 福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心/福建省禽病防治重点实验室, 福建 福州 350013
基金项目:  国家水禽产业体系项目 CARS-43福建省农业科学院“青年科技英才百人计划”专项 YC2015-12福建省畜禽疫病防控技术重大研发平台 2014N2003福建省优良蛋鸭品种与设施化养殖创新产业化工程项目 2014-2016

摘要: 本研究根据前期研究获得的鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子(RaDtxR)基因序列特征设计特异性引物,并在引物上下游引入BamHⅠ和Xho Ⅰ酶切位点,将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-RaDtxR,对其进行IPTG诱导表达条件优化和表达目的蛋白的生物学活性鉴定。SDS-PAGE和Western-blot分析表明,分子量约为51 ku目的蛋白得到表达,并具有良好的生物学活性。本研究成功对鸭疫里默氏菌RaDtxR基因进行表达,为研究鸭疫里默氏菌RaDtxR蛋白生物学功能奠定基础。

English Abstract

  • 鸭疫里默氏菌病是由鸭疫里默氏菌 (Riemerella anatipestifer,RA) 引起的急性接触性传染性病,主要引起发病鸭“三炎”(纤维素心包炎、肝周炎和气囊炎) 典型症状[1-2]

    当前,国际上公认有21种鸭疫里默氏菌血清型 (我国学者还鉴定出新的鸭疫里默氏菌血清型),且不同血清型鸭疫里默氏菌相互之间缺乏有效保护,给鸭疫里默氏菌的防控带来巨大困难[2-5]。本团队在福建省分离鉴定出多种鸭疫里默氏菌血清型流行 (如1、2、3、6、10、11、13、14、17和未知型),其中2型鸭疫里默氏菌占38.14%(45/118),11型占22.03%(26/118),17型占12.71%(15/118),1型占10.17%(12/118),且研究还发现鸭疫里默氏菌流行的优势血清型存在变化[6-9]。前期对鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子 (RaDtxR) 基因研究发现,可在鸭疫里默氏菌1、2、3、11和13型等鸭疫里默氏菌血清型中可检测到RaDtxR基因,且该基因在不同血清型鸭疫里默氏菌均较为保守,但在鸭常见细菌 (大肠杆菌、巴氏杆菌和沙门氏菌) 均未检测到该基因,可作为不同血清型鸭疫里默氏菌诊断的候选靶基因[10-11]。本研究根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子 (RaDtxR) 基因特征设计特异性表达引物,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1后进行优化表达,为后续开展鸭疫里默氏菌RaDtxR生物学功能研究,探讨铁离子浓度对鸭疫里默氏菌生长特性影响奠定研究基础。

    • 2×PCR Master MIX (货号K1081)、蛋白质Marker (PageRuler Prestained Protein Ladder,货号26616) 购自赛默飞世尔科技中国有限公司;抗GST单抗 (ProteinFind Anti-GST Mouse Monoclonal Antibody,货号HT601-01)、酶标二抗 (ProteinFind Goat Anti-Mouse IgG (H+L), HRP Conjugate,货号HS201-01),克隆感受态细胞Trans5α(货号CD201-01) 和原核表达感受态细胞Transetta (DE3)(货号CD801-01) 均购自北京全式金生物技术有限公司;Universal DNA纯化回收试剂盒 (货号DP214) 和快速质粒小提试剂盒 (货号DP105) 均购自天根生化科技 (北京) 有限公司;DAB显色试剂盒 (棕黄色WB专用,货号AR1021) 购自武汉博士德生物工程有限公司。

    • 含有鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子基因全长的阳性克隆质粒 (pMD18-T-RaDtxR)[6]和原核表达载体pGEX-4T-1均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。

    • 根据鸭疫里默氏菌铁依赖抑制子 (RaDtxR) 基因[10]特征,设计特异性表达引物,上游引物RaDtxR-F1:5′-CGC GGA TCC AAC TCT CTT ACA-3′、下游引物RaDtxR-R1:5′-TTA CTC GAG ATC TAG CTT TAC TA-3′,并在上/下游引物5′-端分别引入BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切位点,用下划线表示,目的片段大小约为660 bp,引物均由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。

    • 以pMD18-T-RaDtxR为模板 (PCR扩增前需稀释1:104倍),PCR扩增体系为2×PCR Master Mix 25 μL、上下游引物 (RaDtxR-F1和RaDtxR-R1,20 mmol·L-1 each) 各1 μL、稀释后的质粒 (pMD18-T-RaDtxR) 模板1 μL,补充灭菌去离子水至反应终体积50 μL。反应条件为:94℃预变性5 min后进入循环,94℃变性1 min,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,35个循环结束后,72℃终延伸10 min。将符合预期的目的条带经Universal DNA纯化回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD18-T载体上,获得含有BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切位点的阳性重组质粒 (pMD18-T-RaDtxR-BamH Ⅰ/Xho Ⅰ)。将原核表达载体 (pGEX-4T-1) 和阳性重组质粒 (pMD18-T-RaDtxR-BamH Ⅰ/Xho Ⅰ) 进行BamH Ⅰ/Xho Ⅰ双酶切后胶回收,用T4 DNA连接酶16℃进行连接过夜,转化Trans5α克隆感受态细胞,获得原核表达阳性重组质粒 (pGEX-4T-1-RaDtxR),并送由生工生物工程 (上海) 股份有限公司进行序列测定验证。

    • 将符合试验预期的原核表达阳性重组质粒 (pGEX-4T-1-RaDtxR) 转化Transetta (DE3) 原核表达感受态细胞,挑取单菌落接种于含氨苄青霉素 (100 mg·L-1) 的LB液体培养基中,37℃、200 r·min-1振荡培养过夜,PCR鉴定。取经PCR鉴定符合预期的培养物按2%接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中,37℃、200 r·min-1振荡培养至OD值为0.4~0.6时,进行IPTG浓度和不同诱导时间优化。将优化后的蛋白进行SDS-PAGE电泳 (12%胶) 分析。符合试验预期的蛋白胶进行Western-blot分析,按照常规方法转移至硝酸纤维膜,4℃过夜封闭,以抗GST单抗为一抗作用90 min,HRP标记羊抗鼠IgG为酶标二抗作用90 min,DAB显色试剂盒进行显色。

    • 用所设计的原核表达RaDtxR-F1和RaDtxR-R1进行扩增后,结果显示扩增片段大小约660 bp,其大小与预期的目的片段一致 (图 1)。

      图  1  RaDtxR基因的PCR扩增

      Figure 1.  PCR amplification of RaDtxR gene

    • 对获得的阳性重组表达质粒pGEX-4T-1-RaDtxR,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行双酶切鉴定,获得的阳性重组表达质粒pGEX-4T-1-RaDtxR符合试验预期 (图 2)。

      图  2  重组质粒的双酶切鉴定

      Figure 2.  Double digestion analysis on recombinant plasmids

    • 将原核表达阳性重组质粒pGEX-4T-1-RaDtxR菌液经IPTG (最佳浓度为0.6 mmol·L-1 ) 在37℃条件下诱导5 h后,表达产物经12%的SDS-PAGE检测,可明显约51 ku左右处有一条明显的蛋白带,与预期结果相符,而未诱导的对照菌以及诱导后的空载体细菌没有明显特征条带 (图 3箭头所示条带)。

      图  3  表达蛋白的SDS-PAGE分析

      Figure 3.  SDS-PAGE analysis on expressed proteins

    • 表达产物经SDS-PAGE电泳后,转移至硝酸纤维素膜上进行免疫学 (westerb blot) 反应,结果显示,在51 ku处出现特异性反应条带带,而空载体表达的蛋白则在27 ku处有一反应带,表明目的蛋白得到正确表达 (图 4)。

      图  4  表达蛋白的western blot分析

      Figure 4.  Western blot analysis on expressed proteins

    • 铁离子 (Fe3+、Fe2+) 参与许多病原菌代谢途径,是病原菌代谢所需的重要的辅酶 (或辅助因子),是动物体内各种细菌代谢急需的必须营养元素。但宿主体内自由铁离子浓度极低 (可低至为10-15mol·L-1),无法满足细菌正常生长的需求 (10-7~10-6 mol·L-1),且自然界中绝大部分铁以细菌无法利用的化学态存在[12-14]。铁离子在鸭疫里默氏菌生长中存在重要作用,限铁环境对鸭疫里默氏菌生长繁殖存在抑制作用。通过对限制鸭疫里默氏菌铁离子浓度的蛋白质组学研究发现,Fe12、Fe15、Fe17和Fe18仅在限铁环境中表达 (正常几乎不表达)[15-16]

      铁载体相互作用蛋白 (siderrophore-interacting proteins,SIPs) 存在于许多细菌战,参与细菌摄取铁和调节宿主菌中铁载体基因的转录和代谢,其可将高铁离子 (Fe3+) 还原为Fe2+,使其参与宿主菌的生物代谢过程[17]。此外,过量的Fe2+则通过阻遏铁离子摄取抑制子蛋白 (FUR) mRNA转录,来调节其对宿主细胞的损失作用。前期对铜绿假单胞菌中的铁载体 (脓绿素) 研究也发现,铜绿假单胞菌脓绿素缺失株和铜绿假单胞菌脓绿素受体缺失株都严重影响铜绿假单胞菌的生物学特性,但给予高铁离子 (Fe3+) 对于铜绿假单胞菌脓绿素受体缺失株生物学活性影响不大,推测铜绿假单胞菌存在其他途径的铁摄取机制[18]。对鸭疫里默氏菌基因组解析发现,sip基因鸭疫里默氏菌基因组中唯一的铁载体相互作用蛋白基因。通过缺失强毒株鸭疫里默氏菌sip基因发现其生长速度减缓,对vero细胞的黏附和入侵能力显著降低[19]。但鸭疫里默氏菌的sip基因在部分强毒株和弱毒株中却不存在sip基因,推测鸭疫里默氏菌的摄铁机制还存在其他作用形式。本团队前期研究从多种血清型鸭疫里默氏菌中均检测到RaDtxR基因,这是否是鸭疫里默氏菌另外的铁摄取途径还需要进一步研究。本研究利用原核表达载体pGEX-4T-1,成功表达出鸭疫里默氏菌RaDtxR蛋白,western blot试验显证实表达的融合蛋白具有良好的生物学活性,为研究鸭疫里默氏菌其他铁离子摄取途径提供参考。

      微生物铁离子的吸收和代谢过程依赖载铁体运输系统进行,该系统主要由载铁体及其受体蛋白组成,均需要TonB系统来提供能量交换,关于鸭疫里默氏菌TonB家族已证实存TonB-dependent out membrane receptor和TonB-dependent receptor plug[20-22],下一步我们的工作将开展不同浓度铁离子 (Fe3+、Fe2+) 下,RaDtxR和TonB家族基因表达差异来探究RaDtxR的摄铁作用机制,来进一步阐明鸭疫里默氏菌分子致病机制。

参考文献 (22)

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