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盐碱胁迫下大豆根际土壤真菌多样性分析

张建峰 吉丽 蔺朝龙 田磊 孔钰凤 田春杰

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盐碱胁迫下大豆根际土壤真菌多样性分析

    作者简介: 张建峰(1973-), 男, 副教授, 博士, 研究方向:土壤微生物(E-mail:88657158@qq.com)
    通讯作者: 田春杰(1973-), 研究员, 研究方向:微生态与植物营养(E-mail:tiancj@iga.ac.cn)
  • 基金项目:

    吉林省教育厅项目(2016176);国家重点研发计划项目(2016YFC0501202);吉林省科技厅项目(20160412017XH)

  • 中图分类号: Q939

Fungal Diversity in Rhizosphere Soil of Soybean Fields under Salt-alkali Stress

  • 摘要: 为进一步了解大豆根际土壤中真菌对盐碱胁迫的适应性,利用DGGE技术,通过浇灌盐碱液(A)及覆盖盐碱土(B)两种盐碱胁迫方式对野生大豆和栽培大豆根际真菌多样性进行分析。结果表明:不同盐碱胁迫方式对大豆根际真菌相似性影响较大,如野生大豆和栽培大豆在相同的盐碱胁迫处理A1浓度下,野生大豆和栽培大豆根际真菌群落结构的相似性可达0.70;适当的盐碱浓度可增加大豆根际真菌的均匀度和Shannon指数,如野生大豆在B1浓度时均匀度为0.99,在A2浓度时Shannon指数为1.87;其中对DGGE特异条带测序与基因库比对,获得一些相对优势的菌株如:Fusarium oxysporumActinomucor elegansMarcelleina tuberculisporaMarcelleina persooniiTofieldiaceae environmental sample cloneUncultured eukaryote clone等。
  • 图 1  引物GC-Fung和NS1的琼脂糖凝胶电泳结果

    Fig. 1  Agarose gel electrophoresis of primers GC-Fung and NS1

    图 2  野生大豆和栽培大豆在不同盐碱浓度处理下根际真菌的DGGE图谱

    Fig. 2  DGGE patterns of rhizosphere fungi in G. soja and G. max fields under varied salt-alkali stresses

    图 3  根际真菌DGGE图谱UPGMA聚类分析

    Fig. 3  UPGMA cluster analysis on DGGE bands of rhizosphere fungi

    表 1  处理方式及浓度配比

    Table 1  Treatments and salt-alkali concentrations applied for experimentation

    处理方式 序号 配制比例
    浇灌盐碱
    溶液[11](A)
    CK Hoagland营养液
    A1 NaCl:Na2SO4=1:1
    A2 NaCl:Na2SO4:NaHCO3=1:2:1
    A3 NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3=1:9:9:1
    A4 NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3=1:1:1:1
    覆盖盐
    碱土[12](B)
    B1 300 g碱土
    B2 600 g碱土
    B3 900 g碱土
    B4 1200 g碱土
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    表 2  真菌群落结构的均匀度、Shannon指数

    Table 2  Uniformities and Shannon indices of fungal communities

    类别 项目 CK A处理方式 B处理方式
    A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4
    野生大豆 均匀度 0.96 0.7 0.85 0.98 0.45 0.99 0.97 0.97 0.93
    Shannon指数 1.88 1.45 1.87 1.76 0.31 1.59 1.88 2.4 1.93
    栽培大豆 均匀度 0.95 0.92 0.81 0.94 0.98 0.92 0.78 0.94 0.96
    Shannon指数 2.09 2.03 1.3 1.95 1.91 1.65 1.25 2.34 2.21
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    表 3  测序条带与对应的同源性菌株

    Table 3  Sequencing strips of sample fungiand corresponding homologous strains

    条带编号 同源性菌株
    1 Fusarium oxysporum
    2 Actinomucor elegans
    3 Marcelleina tuberculispora
    4 Marcelleina persoonii
    5 Tofieldiaceae environmental sample clone
    6 Uncultured Cystofilobasidiales(aff.Guehomyces) clone
    7 Uncultured microeukaryote clone
    8 Marcelleina tuberculispora
    9 Uncultured eukaryote clone
    10 Pseudonectria rousseliana
    11 Uncultured fungus clone
    12 Uncultured eukaryote clone
    13 Fusarium sp.
    14 Stachybotrys chlorohalonata strain
    15 Fungal sp.
    16 Uncultured Davidiellaceae clone
    17 Sordariomycetidae sp.
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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2017-05-20
  • 修改稿:  2017-07-12

盐碱胁迫下大豆根际土壤真菌多样性分析

    通讯作者: 田春杰, tiancj@iga.ac.cn
    作者简介: 张建峰(1973-), 男, 副教授, 博士, 研究方向:土壤微生物(E-mail:88657158@qq.com)
  • 1. 吉林农业大学生命科学学院, 吉林 长春 130118
  • 2. 中国科学院东北地理与农业生态研究所, 吉林 长春 130102
基金项目:  吉林省科技厅项目 20160412017XH吉林省教育厅项目 2016176国家重点研发计划项目 2016YFC0501202

摘要: 为进一步了解大豆根际土壤中真菌对盐碱胁迫的适应性,利用DGGE技术,通过浇灌盐碱液(A)及覆盖盐碱土(B)两种盐碱胁迫方式对野生大豆和栽培大豆根际真菌多样性进行分析。结果表明:不同盐碱胁迫方式对大豆根际真菌相似性影响较大,如野生大豆和栽培大豆在相同的盐碱胁迫处理A1浓度下,野生大豆和栽培大豆根际真菌群落结构的相似性可达0.70;适当的盐碱浓度可增加大豆根际真菌的均匀度和Shannon指数,如野生大豆在B1浓度时均匀度为0.99,在A2浓度时Shannon指数为1.87;其中对DGGE特异条带测序与基因库比对,获得一些相对优势的菌株如:Fusarium oxysporumActinomucor elegansMarcelleina tuberculisporaMarcelleina persooniiTofieldiaceae environmental sample cloneUncultured eukaryote clone等。

English Abstract

  • 随着经济快速发展,人们对土地资源的需求不断增加。而我国盐碱化的土壤面积约9.913×107hm2,占陆地面积10.3%[1],并且逐年增加。随着盐碱化土壤面积日益扩大,盐碱胁迫已经成为农业快速发展的一个重要限制因素[2]。大豆是我国的主要油料作物[3],其中栽培大豆是中度耐盐植物,而野生大豆是栽培大豆的祖先种,具有特殊优良性状和抗逆性,遗传资源丰富[4]。研究表明野生大豆和栽培大豆在盐碱胁迫下具有生理特性、叶绿素及光合作用上的差异[5-6]。而微生物作为植物和土壤之间的媒介,尤其是在根际分布密集、活动性强、参与养分循环的根际微生物[7],对植物的生长发育起到至关重要的作用[8]。即根际微生物的多样性变化是植物响应外界胁迫的一个重要体现。

    依据根际微生物种类进行划分,主要为细菌、真菌、放线菌、原生动物和藻类[9]。大多学者对在盐碱环境中数量占优势的根际细菌进行了充分研究,如吴凤芝等[10]在盐胁迫环境下对黄瓜根际土壤中细菌的群落结构进行了研究,得出不同浓度的盐胁迫对黄瓜根际细菌群落结构差异。而根际真菌在维持生物圈生态平衡中同样起到重要作用,因此本文将在盐碱环境下利用DGGE(变性梯度凝胶电泳)技术及DNA克隆测序,对野生大豆和栽培大豆的根际真菌群落进行分析。通过比对野生大豆和栽培大豆根际真菌群落变化特征,获得驯化、栽培作物在盐碱环境下对根际真菌的选择差异,从而为盐碱土中优势菌株的筛选奠定基础。

    • 盐碱土在2016年春季采集于吉林省长春市农安县万顺乡三家子村碱地(北纬44°31′28″,东经124°59′58″,海拔197.9 m,含水率3.56%,pH8.26,电导率541 μs·cm-1)。自然土来源于中国科学院东北地理与农业生态研究所试验田(北纬44°00′1″,东经125°24′24″,海拔202.2 m,含水率3.62%,pH7.56,电导率153.7 μs·cm-1)。

      野生大豆种子由中国科学院东北地理与农业生态研究所提供,栽培大豆种子(吉农18号)来源吉林农业大学种子资源室。

    • 将萌发好的野生大豆和栽培大豆梅花点种于准备好的试验花盆(3 000 g自然土)中,28℃温室培育。出苗后,每天用Hoagland营养液透灌1次,每盆大豆定苗6株,待真叶平展时,选取长势均匀的大豆幼苗随机分18组,其中CK 2组,A和B盐碱胁迫方式各8组,每组3盆,为3次重复。A处理方式:每盆浇灌340mL按照摩尔比配制的盐碱溶液,分3次透灌,对照组只浇Hoagland营养液,每2 d处理1次,处理时间为17:00~18:00,共处理3次后,待大豆开花期收取样本。B处理方式:按照自然土和盐碱土的比例模拟了不同的盐碱胁迫环境,日常管理及收取样本的时间同A处理,均采用抖根法收集附着根系表面2 mm的根际土壤(表 1)。

      表 1  处理方式及浓度配比

      Table 1.  Treatments and salt-alkali concentrations applied for experimentation

      处理方式 序号 配制比例
      浇灌盐碱
      溶液[11](A)
      CK Hoagland营养液
      A1 NaCl:Na2SO4=1:1
      A2 NaCl:Na2SO4:NaHCO3=1:2:1
      A3 NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3=1:9:9:1
      A4 NaCl:Na2SO4:NaHCO3:Na2CO3=1:1:1:1
      覆盖盐
      碱土[12](B)
      B1 300 g碱土
      B2 600 g碱土
      B3 900 g碱土
      B4 1200 g碱土
    • 采用TIANGEN公司的土壤基因组DNA提取试剂盒对根际土壤DNA进行提取。以提取的DNA为模板,进行巢式PCR。第一轮扩增的引物NS1(5′-GTA GTC ATA TGG TTG TCT C-3′)和NS4(5′-CTT CCG TCA ATT CCT TTA AG-3′),扩增条带约1 400 bp。第二轮扩增时,以第1轮扩增产物为模板,用含有GC夹特异性引物GC-Fung(5′-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCGCC CCA TTC CCC GTT ACC CGT TG-3′)和NS1(5′-GTA GTC ATA TGG TTG TCT C-3′)进行扩增。2轮扩增后产物大小均用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检验。

      PCR扩增条件:20 μL扩增体系;94℃预变性4 min,94℃变性30 s,35个循环,52℃退火55 s,72℃延伸50 s,最后72℃保持10 min。

    • 采用JY-TD331A Cell突变检测系统对PCR扩增产物进行分析。8%聚丙烯酰胺凝胶,变性剂浓度梯度为20%~40%,1 ×TAE电泳缓冲液。待胶完全聚合后,60℃,90 V电泳20 min后,加入20 μL第二轮PCR产物,将电压调至200 V,进行预电泳,20 min后将电压调回90 V,时间12 h。经EB替代物核酸染料染色1 h后在凝胶成像仪中观察、拍照[13]

    • 采用Quantity One软件对DGGE图谱进行数字化处理和聚类分析。结合Bio-Dap软件,得出样本的Shannon多样性指数(H′)以及均匀度(E)[14]

    • 对DGGE中特异条带在紫外下进行切胶回收,放于30 μL纯水中4 ℃过夜。以纯水中溶解的DNA为模板,用不含GC夹的NS1,NS4为引物进行PCR,扩增条件同上述巢式PCR,1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后经生工生物工程(上海)股份有限公司测序,所得序列在NCBI数据库中BLAST分析,进行基因的同源比较,选择同源性大于98%的菌株利用MEGA 5.1,Neighbor-Joining Tree,Bootstrap1000构建系统发育进化树,根据进化地位的远近不同,从而确定含有目标基因的真菌种群。

    • 第二轮PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,所得DNA大小片段基本符合要求,大小约500 bp(图 1)。

      图  1  引物GC-Fung和NS1的琼脂糖凝胶电泳结果

      Figure 1.  Agarose gel electrophoresis of primers GC-Fung and NS1

    • 对供试样品的PCR产物进行变性凝胶电泳(图 2)。由于DNA碱基组成不同,在图谱中呈现了不同的梯度。图 2中,收获17条条带,不同的条带间表现出明暗差异,条带的亮度代表了菌落的丰度,如条带6,8等,在大多泳道中较亮,表示该菌株在相应的盐碱胁迫处理方式和浓度下含量丰富。其中部分条带肉眼看着较暗,如条带1,2和条带16,17等,说明这些条带所代表的真菌群落在相应的盐碱胁迫环境下可能不具有适应性。图 2中可见各泳道中含有的条带数量不等,其中有些条带在部分处理下共有,如条带7,8,9,10等。一方面表明这些条带所代表菌群相对稳定,另外,共有条带的数目间接反映了各样品间的真菌群落相似性和对盐碱胁迫的适应性。

      图  2  野生大豆和栽培大豆在不同盐碱浓度处理下根际真菌的DGGE图谱

      Figure 2.  DGGE patterns of rhizosphere fungi in G. soja and G. max fields under varied salt-alkali stresses

    • 为了进一步了解野生大豆和栽培大豆根际真菌在不同盐碱胁迫方式和不同处理浓度上的选择差异,进行了聚类分析(图 3)。在相同的盐碱胁迫方式下,大豆根际真菌相似性较高。如野生大豆的A1和栽培大豆的A1根际真菌群落结构的相似性达0.70,野生大豆的B3和B1处理相似性为0.86。从而可知,盐碱胁迫的处理方式对大豆根际真菌相似性影响较大,同时,品种的差异性对此也会产生一定的影响,如野生大豆B4和栽培大豆B3,相似性为0.41。

      图  3  根际真菌DGGE图谱UPGMA聚类分析

      Figure 3.  UPGMA cluster analysis on DGGE bands of rhizosphere fungi

    • 不同盐碱环境下根际真菌的均匀度及Shannon指数见表 2。A盐碱胁迫处理方式时,野生大豆在A2处理下具有较高的Shannon指数为1.87,栽培大豆在A1处理下Shannon指数较高为2.03,均略低于对照组,可见A处理方式不同盐碱浓度使野生大豆和栽培大豆的Shannon指数降低。而在B盐碱胁迫处理下,野生大豆和栽培大豆在均在B3处理下有较高的Shannon指数,且均高于对照组。适当的盐碱环境可增加大豆根际真菌的Shannon指数和均匀度。

      表 2  真菌群落结构的均匀度、Shannon指数

      Table 2.  Uniformities and Shannon indices of fungal communities

      类别 项目 CK A处理方式 B处理方式
      A1 A2 A3 A4 B1 B2 B3 B4
      野生大豆 均匀度 0.96 0.7 0.85 0.98 0.45 0.99 0.97 0.97 0.93
      Shannon指数 1.88 1.45 1.87 1.76 0.31 1.59 1.88 2.4 1.93
      栽培大豆 均匀度 0.95 0.92 0.81 0.94 0.98 0.92 0.78 0.94 0.96
      Shannon指数 2.09 2.03 1.3 1.95 1.91 1.65 1.25 2.34 2.21

      表 2中均匀度结果显示,在A盐碱胁迫处理方式下,野生大豆A3浓度的根际真菌的均匀度较高为0.98,栽培大豆在A4浓度具有较高的均匀度为0.98。B盐碱胁迫处理下,野生大豆在B1浓度,有较高的均匀度指数为0.99,栽培大豆则是在B4处理浓度均匀度指数较高为0.96。

    • 对野生大豆和栽培大豆真菌的DGGE指纹图谱中部分特异条带进行切胶,获得17条特异条带后进行回收测序,通过Blast与GenBank数据库比对,结果如表 3所示。其中1号条带Sordariomycetidae sp.(球壳亚纲)和16号条带Uncultured Davidiellaceae clone存在于野生大豆的高盐碱浓度B3,B4处理中;13号条带Fusarium oxysporum存在野生大豆的B2处理及栽培大豆A1处理;2号条带Actinomucor elegans(雅致放射毛霉)在栽培大豆A2和B3浓度中;Marcelleina tuberculispora在野生大豆A2、B3处理及栽培大豆B3处理。4号条带的同源菌株Marcelleina persoonii在本试验的条件下,存在于CK以及野生大豆和栽培大豆A1处理和野生大豆的B3处理。5号条带Tofieldiaceae environmental sample clone存在野生大豆和栽培大豆A4盐碱处理以及野生大豆B2、B3处理;6号条带Uncultured Cystofilobasidiales和8号条带Marcelleina tuberculispora是野生大豆所特有;7号条带Uncultured microeukaryote clone在A处理方式时,野生大豆和栽培大豆中分布广泛;9号条带Uncultured eukaryote clone在野生大豆A2、A3和B2以及栽培大豆A1、B1处理中被检测到;10号条带Pseudonectria rousseliana、12号条带Uncultured eukaryote clone、13号条带Fusarium sp.、14号条带stachybotrys chlorohalonata等在A、B两种处理方式下均广泛存在。

      表 3  测序条带与对应的同源性菌株

      Table 3.  Sequencing strips of sample fungiand corresponding homologous strains

      条带编号 同源性菌株
      1 Fusarium oxysporum
      2 Actinomucor elegans
      3 Marcelleina tuberculispora
      4 Marcelleina persoonii
      5 Tofieldiaceae environmental sample clone
      6 Uncultured Cystofilobasidiales(aff.Guehomyces) clone
      7 Uncultured microeukaryote clone
      8 Marcelleina tuberculispora
      9 Uncultured eukaryote clone
      10 Pseudonectria rousseliana
      11 Uncultured fungus clone
      12 Uncultured eukaryote clone
      13 Fusarium sp.
      14 Stachybotrys chlorohalonata strain
      15 Fungal sp.
      16 Uncultured Davidiellaceae clone
      17 Sordariomycetidae sp.
    • 本文利用DGGE技术对野生大豆和栽培大豆根际真菌在盐碱胁迫的适应性进行了表观阐述。从DGGE指纹图谱可知,不同的真菌群落对盐碱环境的适应能力不同,有些菌株的条带较亮较多,说明了其含量丰富。通过对根际真菌的相似性分析,进一步说明盐碱胁迫的方式在根际真菌相似性的分类上起主导作用。通过对真菌群落结构的均匀度、Shannon指数分析可知,适当的盐碱浓度会增加大豆根际真菌的多样性。

      DGGE指纹图谱中代表性条带测序结果表明:Fusarium oxysporumActinomucor elegansMarcelleina tuberculisporaUncultured Davidiellaceae cloneSordariomycetidae sp.(球壳亚纲)在大豆根际微生态系统中相对较少,初步认为这些菌株在本试验设计的盐碱胁迫环境中不具有良好的适应性,而Uncultured microeukaryote clonePseudonectria rousselianaUncultured eukaryote cloneFusarium sp.、stachybotrys chlorohalonata在A和B两种处理方式下均广泛存在,表明这些菌株对盐碱胁迫的耐受能力较强。其中Uncultured Davidiellaceae cloneSordariomycetidae sp.(球壳亚纲)为野生大豆B处理方式下高盐碱浓度的优势菌,因此针对这些抗盐碱菌株有必要进行后续的开发利用。

      在生态系统中,植物作为第一生产者将大气中的二氧化碳和水通过自身光合作用,转运至地下[8]。由于土壤中存在着大量的微生物,它们在土壤的碳、氮循环中起到重要作用[15],可以很好地将有机态养分转化为无机态,维持土壤生态环境的同时有助于植物的生长。因此土壤微生物作为植物有效养分的储备库,对土壤的可持续性起着着重要作用[16]。土壤中真菌数量虽少,但种类繁多,是土壤生物量和有机质分解的主要组成部分[17]。因此本文通过DGGE技术更进一步的揭开了野生大豆和栽培大豆在盐碱环境下根际真菌多样性的神秘面纱,但由于现代分子生物学技术仍存在局限性,留给我们的是更加广阔的研究空间,如测序条带中的11、15等,无法得知具体的属种,因此有必要进行深入研究,期许拥有更加清晰的视野,得知根际真菌与盐碱环境的内在联系。

参考文献 (17)

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