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丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740生物信息学分析

张靖鹏 江锦秀 林裕胜 游伟 胡奇林

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丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740生物信息学分析

    作者简介: 张靖鹏(1988-), 男, 硕士研究生, 主要从事动物传染病研究(E-mail:870063543@qq.com)
    通讯作者: 胡奇林(1963-), 男, 硕士, 研究员, 主要从事动物传染病学和免疫学研究(E-mail:hql562713@163.com)
  • 基金项目:

    国家重点研发计划项目(2016YFD0500906);福建省农业科学院科技创新团队建设项目(2017-09);福建省农业科学院青年人才创新基金(YC20180-3)

  • 中图分类号: S852.62

Bioinformatics of Specific Gene Mmc-3740 of Mycoplasma mycoides subsp. capri

  • 摘要: 为研究丝状支原体山羊亚种Mmc-3740基因编码蛋白的结构与功能,运用生物信息学软件,对该基因编码蛋白的二级结构、跨膜区域、信号肽等生物信息进行预测及分析。结果显示,该基因编码蛋白拥有α螺旋、延伸链、随机卷曲结构;有信号肽,亚细胞定位在细胞外或者细胞质内,可能为分泌蛋白,具有较高的免疫原性,抗原表位偏高的区域主要集中在氨基酸序列的第28~51、60~67、80~130位处;蛋白分子式为C607H1000N184O261S5,分子量15.21 kD,等电点(PI值)为4.42,在微生物体内半衰期较短,为不稳定蛋白。该结果为Mmc-3740编码蛋白的进一步研究提供基础数据。
  • 图 1  Mmc-3740编码蛋白α螺旋、延伸链、随机卷曲结构分布

    Fig. 1  Distribution of alpha helix, extension chain and random coil structure of Mmc-3740

    图 2  signalP4.1预测结果

    Fig. 2  SignalP4.1 prediction

    图 3  SOSUI预测结果

    Fig. 3  SOSUI prediction

    图 4  DAS预测结果

    Fig. 4  DAS prediction

    图 5  TMHMM的预测结果

    Fig. 5  TMHMM prediction

    图 6  IEBD预测抗原表位结果

    Fig. 6  IEBD prediction

    表 1  Mmc-3740编码蛋白二级结构预测结果

    Table 1  Predicted Mmc-3740 secondary structure

    结构 α-螺旋 310-螺旋 π-螺旋 β-折叠桥 延伸链 β-转角 弯曲区 随机卷曲 模糊区 其他
    碱基数 30 0 0 0 18 0 0 101 0 0
    占比/% 20.13 0.00 0.00 0.00 12.08 0.00 0.00 67.79 0.00 0.00
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    表 2  SOSUI预测结果

    Table 2  SOSUI prediction

    N端 跨膜区 C端 类型 长度 结果
    4 LLTLLGSISIVAS TASVAIACTD 26 一级结构 23 该氨基酸序列是一种膜蛋白,其中有1个跨膜螺旋
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    表 3  CELLO预测结果

    Table 3  CELLO prediction

    CELLO预测定位 数值
    细胞外 1.902 *
    细胞质 1.295 *
    周质 0.993
    外膜 0.451
    内膜 0.359
    注:标有*号为可信值。
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    表 4  Mmc-3740编码蛋白氨基酸组成

    Table 4  Amino acids of Mmc-3740

    氨基酸 数量 占比/%
    丙氨酸Ala (A) 7 4.90
    精氨酸Arg (R) 2 1.40
    天冬酰胺Asn (N) 15 10.40
    天冬氨酸Asp (D) 9 6.20
    半胱氨酸Cys (C) 1 0.70
    谷氨酰胺Gln (Q) 5 3.50
    谷氨酸Glu (E) 16 11.10
    甘氨酸Gly (G) 7 4.90
    组氨酸His (H) 2 1.40
    异亮氨酸Ile (I) 6 4.20
    亮氨酸Leu (L) 6 4.20
    赖氨酸Lys(K) 10 6.90
    甲硫氨酸Met (M) 4 2.80
    苯丙氨酸Phe (F) 0 0.00
    脯氨酸Pro (P) 3 2.10
    丝胺酸Ser (S) 32 22.20
    苏氨酸Thr (T) 14 9.70
    色氨酸Trp (W) 0 0.00
    酪氨酸Tyr (Y) 0 0.00
    颉氨酸Val (V) 5 3.50
    吡咯赖氨酸Pyl (O) 0 0.00
    硒半胱氨酸Sec (U) 0 0.00
    下载: 导出CSV
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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2018-03-22
  • 修改稿:  2018-08-23

丝状支原体山羊亚种特异性蛋白基因Mmc-3740生物信息学分析

    通讯作者: 胡奇林, hql562713@163.com
    作者简介: 张靖鹏(1988-), 男, 硕士研究生, 主要从事动物传染病研究(E-mail:870063543@qq.com)
  • 福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福建 福州 350013
基金项目:  福建省农业科学院青年人才创新基金 YC20180-3国家重点研发计划项目 2016YFD0500906福建省农业科学院科技创新团队建设项目 2017-09

摘要: 为研究丝状支原体山羊亚种Mmc-3740基因编码蛋白的结构与功能,运用生物信息学软件,对该基因编码蛋白的二级结构、跨膜区域、信号肽等生物信息进行预测及分析。结果显示,该基因编码蛋白拥有α螺旋、延伸链、随机卷曲结构;有信号肽,亚细胞定位在细胞外或者细胞质内,可能为分泌蛋白,具有较高的免疫原性,抗原表位偏高的区域主要集中在氨基酸序列的第28~51、60~67、80~130位处;蛋白分子式为C607H1000N184O261S5,分子量15.21 kD,等电点(PI值)为4.42,在微生物体内半衰期较短,为不稳定蛋白。该结果为Mmc-3740编码蛋白的进一步研究提供基础数据。

English Abstract

  • 丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)是丝状支原体簇的成员之一,可引起羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPGS)、山羊传染性无乳症(Caprine contagious agalactia)等[1]。羊支原体肺炎在山羊和绵羊中广泛流行, 是一种危害严重的疾病[2],在羊群中传播迅速,发病率为22%~30%,有的可高达60%~80%,死亡率为15%~30%[3],给羊饲养业造成了严重的经济损失。该病临床表现为高热、咳嗽、纤维素性肺炎和胸膜炎[4],其临床症状和病理变化与山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.capripneumoniae,Mccp)引起的山羊传染性胸膜肺炎相似。Mmc与Mccp及山羊支原体山羊亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capricolum,Mcc)同属丝状支原体簇(mycoplasma mycoides cluster,Mm Cluster),其基因组同源性很高,理化特性相似,血清学上存在交叉反应,因此不易通过血清学方法进行准确鉴定[5]。目前Mmc的检测方法主要包括支原体分离培养[6]、PCR[7]、qRT-PCR[8]等。因此,寻找Mmc特异性抗原,以建立特异的血清学检测方法成为关注的焦点。目前已取得了一定的进展,已报道特异性基因LPPA基因[9]和由10个ORF串联而成的麦芽糊精/麦芽糖(maltodextrin/maltose)基因簇[10],但未见后续研究报道。近年来,国内外完成了Mmc、Mccp和Mcc等全基因组序列的测序分析,为新基因的寻找与分析奠定了基础。

    生物信息学对基因的预测有着实验生物学无法比拟的快速和方便的优势,因此备受研究者的青睐[11]。本研究前期通过对Mmc与丝状支原体簇的其他成员的比对发现Mmc-3740编码的氨基酸序列与丝状支原体簇的其他成员间相似性低,是Mmc所特有的基因,但其结构和功能还不清楚。因此,本研究利用生物信息学软件对Mmc-3740所编码蛋白的二级结构、疏水性、跨膜区域、信号肽等生物信息进行预测及分析,以期为该蛋白功能的深入研究提供参考。

    • 通过NCBI与DNAstar软件的比对,发现Mmc-3740基因位于丝状支原体山羊亚种95010株(登录号:FQ377874.1)全基因组序列的第485 951~486 385 bp位,长度435 bp,为完整的开放阅读框架(Open Reading Frame, ORF),编码141个氨基酸。其编码的氨基酸序列只与Mmc的PG3株相似,相似性78%,而与丝状支原体簇的其他成员间没有相似性,为Mmc所特有的基因片段。

    • 利用SOPMA在线软件分析,发现Mmc-3740基因编码蛋白拥有α螺旋、延伸链、随机卷曲结构,分布如图 1,其中α-螺旋占20.13%,主要位于其编码氨基酸序列的第1~8、14~19、47~50、137~144位,延伸链占12.08%,主要位于该氨基酸序列的第20~23、55~58、81~83、101~103位,随机卷曲占67.79%,主要位于该氨基酸序列的第24~46、59~70、71~80、85~100、104~136位(表 1)。

      表 1  Mmc-3740编码蛋白二级结构预测结果

      Table 1.  Predicted Mmc-3740 secondary structure

      结构 α-螺旋 310-螺旋 π-螺旋 β-折叠桥 延伸链 β-转角 弯曲区 随机卷曲 模糊区 其他
      碱基数 30 0 0 0 18 0 0 101 0 0
      占比/% 20.13 0.00 0.00 0.00 12.08 0.00 0.00 67.79 0.00 0.00

      图  1  Mmc-3740编码蛋白α螺旋、延伸链、随机卷曲结构分布

      Figure 1.  Distribution of alpha helix, extension chain and random coil structure of Mmc-3740

    • 利用SignalP4.1和Sosui预测信号肽,SignalP4.1预测结果(图 2)显示,D值为0.655,信号肽的切割位点位于氨基酸序列第23~24位。Sosui预测(图 3)有信号肽,位于氨基酸序列的第1~23位,二者预测结果一致,因此推测Mmc-3740蛋白是分泌蛋白。

      图  2  signalP4.1预测结果

      Figure 2.  SignalP4.1 prediction

      图  3  SOSUI预测结果

      Figure 3.  SOSUI prediction

    • 利用DAS在线预测软件和TMHMM在线预测,结果(图 4)发现,Mmc-3740蛋白存在跨膜区,预测的跨膜区域为氨基酸序列的第6~25、7~22、129~134位。而TMHMM的预测结果(图 5)显示该蛋白没有跨膜区,均分布在膜外。利用Sosui进行预测(表 2),结果显示该蛋白为一种膜蛋白,有跨膜区域,位于氨基酸序列的第4~26位。

      图  4  DAS预测结果

      Figure 4.  DAS prediction

      图  5  TMHMM的预测结果

      Figure 5.  TMHMM prediction

      表 2  SOSUI预测结果

      Table 2.  SOSUI prediction

      N端 跨膜区 C端 类型 长度 结果
      4 LLTLLGSISIVAS TASVAIACTD 26 一级结构 23 该氨基酸序列是一种膜蛋白,其中有1个跨膜螺旋
    • CELLO预测结果(表 3)可以看出Mmc-3740蛋白的亚细胞定位在细胞外或者细胞质内,可能是一种分泌型蛋白。

      表 3  CELLO预测结果

      Table 3.  CELLO prediction

      CELLO预测定位 数值
      细胞外 1.902 *
      细胞质 1.295 *
      周质 0.993
      外膜 0.451
      内膜 0.359
      注:标有*号为可信值。
    • IEBD预测(http://www.iedb.org/home_v3.php)结果显示Mmc-3740蛋白抗原指数平均值为1.081,最高2.294,偏高的区域主要集中于氨基酸序列的第28~51、60~67、80~130位(图 6)。因此,预测该蛋白有3个抗原性较好的区段,其中第80~130位为抗原性最强的区段。推测该蛋白可引起机体的免疫应答。将其进行体外表达后,可用于Mmc检测方法的建立。

      图  6  IEBD预测抗原表位结果

      Figure 6.  IEBD prediction

    • 结合Sosui和ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)分析得出,Mmc-3740编码蛋白分子式:C607H1000N184O261S5, 总原子数量2 057,分子质量15 211.99,等电点(PI值)4.42。氨基酸组成如表 4,带负电的氨基酸残基(Asp+Glu) 25个,带正电的氨基酸残基(Arg+Lys) 12个。平均亲疏水性:-1.121,为亲水蛋白。半衰期预测:10 h(大肠杆菌体内),20 h(酵母体内),30 h(网织红细胞内)。不稳定指数为48.43,该蛋白质为不稳定蛋白。

      表 4  Mmc-3740编码蛋白氨基酸组成

      Table 4.  Amino acids of Mmc-3740

      氨基酸 数量 占比/%
      丙氨酸Ala (A) 7 4.90
      精氨酸Arg (R) 2 1.40
      天冬酰胺Asn (N) 15 10.40
      天冬氨酸Asp (D) 9 6.20
      半胱氨酸Cys (C) 1 0.70
      谷氨酰胺Gln (Q) 5 3.50
      谷氨酸Glu (E) 16 11.10
      甘氨酸Gly (G) 7 4.90
      组氨酸His (H) 2 1.40
      异亮氨酸Ile (I) 6 4.20
      亮氨酸Leu (L) 6 4.20
      赖氨酸Lys(K) 10 6.90
      甲硫氨酸Met (M) 4 2.80
      苯丙氨酸Phe (F) 0 0.00
      脯氨酸Pro (P) 3 2.10
      丝胺酸Ser (S) 32 22.20
      苏氨酸Thr (T) 14 9.70
      色氨酸Trp (W) 0 0.00
      酪氨酸Tyr (Y) 0 0.00
      颉氨酸Val (V) 5 3.50
      吡咯赖氨酸Pyl (O) 0 0.00
      硒半胱氨酸Sec (U) 0 0.00
    • 羊支原体性肺炎(MPGS)在我国多个地区发生,发病率高、传播速度快、波及范围大,给我国养羊业造成了重大经济损失[13]。Mmc作为MPGS的重要病原之一,与Mcc等同属于丝状支原体簇的成员。该簇成员包括在遗传学和血清学上非常相近的6种支原体[14],分为3个亚群,分别是山羊支原体、丝状支原体和李奇氏支原体亚群[15],其同源性高、血清学方面存在交叉反应。为了快速、高效地诊断Mmc引起的MPGS,寻找特异性抗原,建立相应的检测方法成为国内外学者关注的重点。

      目前已公布的Mmc全基因组序列只有95 010和PG3 2株,本课题组前期通过对Mmc与丝状支原体簇的其他成员的基因组分析发现,Mmc-3740编码的氨基酸序列与丝状支原体簇的其他成员间相似性低,是Mmc特有的基因。同时,经基因序列比对发现,95 010株Mmc-3740基因与PG3的相似性为87%,后续研究中用基于95 010株序列设计的引物可以从Mmc临床分离株中扩增出Mmc-3740基因相应长度的片段,测序后发现相似性约为90%,表明Mmc-3740基因是Mmc的保守基因之一。

      生物信息学预测可以破译隐藏在DNA序列中的遗传信息,通过对基因信息进行深入分析,预测蛋白的结构和功能,在生物、医药、农业等研究领域越来越被重视[16]。本研究首次利用生物信息学软件对Mmc-3740编码蛋白进行生物信息学预测,结果显示,该基因编码蛋白除存在常见的α螺旋结构外,还有延伸链、随机卷曲结构。螺旋和折叠化学键能是能否牢固维持蛋白高级结构的重要条件,化学键能越高蛋白结构越牢固,延伸链则构成其活性位点[17];信号肽分析发现该基因所编码的蛋白具有信号肽,新生蛋白通常在位于其N端的信号肽的指引下到达细胞特定区域,并由其介导跨膜转运[18],因此推测其可能是一种分泌型蛋白。蛋白质亚细胞定位与其功能密切相关,预测蛋白的亚细胞定位,对于了解蛋白质的性质和功能具有重要意义[19],本研究利用CELLO进行亚细胞定位的预测结果显示,Mmc-3740蛋白定位于细胞外或者细胞质内,结合信号肽的预测,推测其在原核表达中能获得可溶性表达。跨膜区预测中,不同软件的预测结果不同,所用的3种软件都没有针对支原体的选项,因此,推测跨膜区预测软件在支原体蛋白的预测并不成熟,其结果只能作为参考。与实验验证抗原性相比,通过生物信息学方法预测抗原表位耗时短且易于操作[20]。Mmc-3740蛋白抗原表位预测结果显示其抗原指数较高,亲水性预测显示其表面拥有亲水基团,抗原亲水性决定B细胞抗原表位[21],推测这些位点容易成为抗体识别的抗原表位区域,预测该蛋白抗原性良好,体外表达的产物可用于Mmc检测方法的建立或作为Mmc的保护性抗原,用于该病的免疫防控。稳定性预测结果显示该蛋白为不稳定蛋白。

      综上所述,Mmc-3740编码蛋白为Mmc所特有的抗原性良好的分泌型蛋白,推测可用于Mmc特异检测方法的建立。

参考文献 (21)

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