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利用基因组编辑技术定点突变IPA1基因创制水稻新株型材料

刘华清 孙庆山 杨绍华 周淑芬 王锋

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利用基因组编辑技术定点突变IPA1基因创制水稻新株型材料

    作者简介: 刘华清(1967—), 男, 博士, 副研究员, 主要从事水稻遗传育种研究(E-mail:lhq@fjage.org)
    通讯作者: 王锋(1963—), 男, 博士, 研究员, 主要从事水稻分子育种研究(E-mail:wf@fjage.org)
  • 基金项目:

    福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2015R1019-1);福建省科技重大专项(2015NZ0002-3)

  • 中图分类号: S511;S330;Q812

Morphological Alternation of Rice Plant by Site-Directed Mutagenesis on IPA1 Gene

  • 摘要:   目的  水稻株型改良是提高水稻产量的一个有效途径。水稻理想株型基因IPA1是一个调控水稻株型的关键基因,利用基因组编辑技术(TALENs技术)定点突变水稻IPA1基因,了解IPA1基因不同序列变异的株型效应,为进一步利用IPA1基因创制实用型水稻新株型材料奠定基础。  方法  利用TALENs技术定点突变优良恢复系明恢86的IPA1基因,通过测序鉴定突变体,种植于标准小区,调查分析其株型相关性状。  结果  利用TALENs技术获得了8种不同序列突变的水稻ipa1突变体,并通过转基因植株自交结合PCR分析筛选到去除了TALENs表达框,获得4种不含外源转基因成分的纯合突变体材料(IPA1基因表达区分别缺失2、4、16、23 bp)。表型分析发现,IPA1基因突变能够显著改变水稻的株高、有效穗数、穗长及穗粒数等性状。与野生型比较,缺失移码突变体株高降低7.9%~11.4%,有效穗数增加46.9%~68.4%,穗长短24.2%~29.3%,穗粒数减少31%~34%,结实率和千粒重差异不明显。  结论  利用TALENs技术定点突变水稻IPA1基因能够明显改变水稻株高、有效穗数、穗长及穗粒数等主要性状,产生水稻新株型。
  • 图 1  TALENs编辑水稻IPA1基因的靶位点

    Fig. 1  Target sites in rice IPA1 gene for TALENs editing

    图 2  基因编辑T0代阳性转基因植株筛选

    Fig. 2  Screening of gene-edited T0 mutant transgenic plants

    图 3  TALENs编辑基因IPA1的序列突变类型

    Fig. 3  Mutation types of IPA1 produced by TALENs

    图 4  不含转基因成分(TALENs载体成分)的T1植株筛选

    Fig. 4  Selection of T1 plants without transgenic (TALENs vector) components

    图 5  不含转基因成分的突变体筛选

    Fig. 5  Selection on mutants free of transgenic components

    图 6  IPA1基因编辑突变体株型

    Fig. 6  Plant architectures of wild-type and IPA1 gene edited mutants

    表 1  基因编辑的靶位点序列

    Table 1  Target sequence for gene-editing

    靶位点编号
    Target Num.
    靶位点序列
    Target sequences
    TIPA1-1 左臂Left arm:GCCGCCACCGACTCGAG
    右臂Right arm:TCCCATGGCTGGGTTGACA
    TIPA1-2 左臂Left arm:CGGTGCCGCCACCGACT
    右臂Right arm:GGGTTGACAGAAGAG
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    表 2  基因编辑再生植株阳性率及靶位点突变率

    Table 2  Positive transgenic and mutation rates of target gene editing on plants

    载体名称
    Vector name
    再生克隆数 阳性克隆数 阳性率/% 突变克隆数 阳性克隆突变率/%
    TIPA1-1 38 36 94.7 2 5.6
    TIPA1-2 67 57 85.1 0 0.0
    注:再生克隆数Num. of regenerated clones,阳性克隆数Num. of positive clones,阳性率Positive percentage,突变克隆数Num. of mutation clones,阳性克隆突变率Mutation percentage of positive clones。
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    表 3  ipa1纯合突变体主要农艺性状

    Table 3  Main agronomic traits of IPA1 mutants

    样品编号
    Sample NO.
    株高
    Plant height/cm
    有效穗数
    Effective panicle number
    穗长Average of panicle length/cm 穗粒数
    grains per panicle
    结实率
    SettingPercentage/%
    千粒重1000-grain weight/g
    ipa1-CK 102.2Aa 9.8A 25.6 A 178.2Aa 81.4a 28.3 a
    ipa1-2 90.6Bb 15.8C 19.3B 122.7Bb 79.20 a 28.1 a
    ipa1-4 90.7Bb 16.5C 19.4B 121.2Bb 83.70 a 28.6 a
    ipa1-16 94.1Bc 14.4B 18.1C 113.2Bc 82.50 a 28.8 a
    注:ipa1-CK为杂合突变体分离得到的野生型;ipa1-2、ipa1-4、ipa1-16分别为T2代缺失2、4、16 bp的纯合突变体。表中同列数据后无相同大、小写字母者分别表示同一性状不同样品材料之间差异达极显著水平(P < 0.01)和显著水平(P < 0.05)。
    Note:ipa1-CK is a wild-type from progeny of a heterozygous mutant; ipa1-2, ipa1-4, and ipa1-16 are T2 homozygous mutants with 2 bp, 4 bp, and 16 bp detection, respectively. Data in a same column with different capital letters indicate extremely significant differences (P < 0.01) and with different lowercase letters, significant differences (P < 0.05).
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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2019-04-12
  • 修改稿:  2019-07-14

利用基因组编辑技术定点突变IPA1基因创制水稻新株型材料

    通讯作者: 王锋, wf@fjage.org
    作者简介: 刘华清(1967—), 男, 博士, 副研究员, 主要从事水稻遗传育种研究(E-mail:lhq@fjage.org)
  • 福建省农业科学院生物技术研究所/福建省农业遗传工程重点实验室, 福建 福州 350003
基金项目:  福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项 2015R1019-1福建省科技重大专项 2015NZ0002-3

摘要:   目的  水稻株型改良是提高水稻产量的一个有效途径。水稻理想株型基因IPA1是一个调控水稻株型的关键基因,利用基因组编辑技术(TALENs技术)定点突变水稻IPA1基因,了解IPA1基因不同序列变异的株型效应,为进一步利用IPA1基因创制实用型水稻新株型材料奠定基础。  方法  利用TALENs技术定点突变优良恢复系明恢86的IPA1基因,通过测序鉴定突变体,种植于标准小区,调查分析其株型相关性状。  结果  利用TALENs技术获得了8种不同序列突变的水稻ipa1突变体,并通过转基因植株自交结合PCR分析筛选到去除了TALENs表达框,获得4种不含外源转基因成分的纯合突变体材料(IPA1基因表达区分别缺失2、4、16、23 bp)。表型分析发现,IPA1基因突变能够显著改变水稻的株高、有效穗数、穗长及穗粒数等性状。与野生型比较,缺失移码突变体株高降低7.9%~11.4%,有效穗数增加46.9%~68.4%,穗长短24.2%~29.3%,穗粒数减少31%~34%,结实率和千粒重差异不明显。  结论  利用TALENs技术定点突变水稻IPA1基因能够明显改变水稻株高、有效穗数、穗长及穗粒数等主要性状,产生水稻新株型。

English Abstract

    • 【研究意义】提高水稻产量一直是水稻育种研究的重要内容。前人研究表明,理想株型与杂种优势利用相结合是提高水稻产量的有效途径[1-2]。改良水稻株型实质是协调水稻产量相关性状——有效穗数、穗粒数和粒重等主要性状之间的关系。传统杂交育种方法改良水稻产量相关性状存在的不确定性和盲目性,大大限制了水稻高产育种水平的提高。大量水稻产量相关性状基因的克隆及相关生物技术的应用,特别是近几年发展起来的基因组编辑技术的应用,为定向改良水稻株型和产量相关性状创造了条件,也提供了一条有效途径。【前人研究进展】基因组编辑技术(genome editing)是一种在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。其基本原理是利用序列特异性核酸酶(sequence-specific nucleases,SSNs)锚定基因组特定的位点,产生DNA双链断裂,激活细胞自身修复机制,进行非同源末端连接或同源重组修复。在修复过程中会发生基因序列改变,从而实现基因定点缺失、定点插入或替换等突变,从而达到定点改造基因组的目的[3]。目前用于基因组编辑的序列特异性核酸酶(SSNs)主要有3类:锌指核酸酶(Zinc finger nuclease, ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9)系统。近年来,随着基因组编辑技术的发展和完善,基因组编辑技术开始广泛应用于作物遗传及育种种质创新研究[4]。【本研究切入点】水稻理想株型基因Ideal Plant Architecture 1(IPA1)是决定株型的关键调节因子,编码SPL14蛋白,是一个SPL转录因子家族成员, 其表达主要受miRNA156调节[5-6]。当miRNA156在基因IPA1上的识别位点发生突变时,干扰miRNA156调控IPA1 mRNA的降解,使IPA1表达量增高,导致水稻植株的分蘖数减少,株高和穗粒数增加,形成所谓的分蘖少、穗大、株型好的“理想株型”[5-7]。但由于不同的生态环境及育种目标,对株型的要求有所差异,使得理想株型的应用受到很大限制。通常,水稻多穗型品种较少蘖、大穗型品种有更好的适应性。本研究从创制与理想株型相反的水稻株型材料入手,探讨创制多穗型水稻株型的方法,并了解其株型特征。【拟解决的关键问题】基于基因组编辑技术在基因定向突变方面的有效性,本研究利用TALENs技术,定点突变明恢86背景下的IPA1基因,创制一批IPA1基因突变体,获得与理想株型相反的水稻株型材料,为水稻株型改良提供新的遗传变异材料。

    • 本研究所用受体水稻品种明恢86,是一个优良的籼型三系杂交稻恢复系[8]。所用菌株由本实验室保存;TALEN左臂骨架载体、TALEN右臂骨架载体、植物表达载体p1300M等质粒载体均由上海斯丹赛生物技术有限公司提供。

    • 利用粳稻日本晴基因组上IPA1基因的序列信息(NCBI:http://www.ncbi.nlm.gov/),考虑IPA1基因序列较长,设计了两对分段扩增引物(IPA1-F1:GCT ACA GTC TCC TTC CCA CC, IPA1-R1:CAG GCA AGT CAC ATC ACT CAA C; IPA1-F2:CAC AGC AGC AGT GGA TAG GAI,PA1-R2:CGC ATT ATT ATT CAT CAC AGG GA),通过PrimeSTAR HS DNA Polymerase PCR扩增体系,扩增获得明恢86中IPA1基因全长序列,与日本晴进行比对分析。

      靶位点的设计和选择是利用相关TALENs靶位点设计辅助网站(或www.talendesign.org/)获得基因可供选择的靶位点,综合基因特点选择最优靶位点[9]

    • 合适靶位点选取后,明确TALEN左臂、右臂识别序列,根据上海斯丹赛公司提供的试剂盒使用说明书及模块组合方法,首先分别合成左、右臂识别元件及其连接的FokI核酸酶的表达载体。在由上海斯丹赛生物技术有限公司提供的TALEN左臂骨架载体、TALEN右臂骨架载体的基础上添加识别靶位的TALE蛋白的表达元件。验证正确后,再将左、右臂识别元件及其连接的FokI核酸酶的表达元件连接到植物表达载体p1300M上,并通过测序确定,构建完整的TALENs表达载体。将构建好的表达质粒导入农杆菌LBA4404,采用本实验室创建的高效农杆菌介导籼稻胚性愈伤转化方法[10],获得转基因再生植株。

    • 检测TALENs表达载体框是否成功插入到再生水稻基因组中,本研究通过TALENs表达载体框引物(TF:5- TGA CCG AGT TCA AGT TCC-3′;TR:5′-TTG CGG GAC TCT AAT CA-3′)PCR分析遗传转化苗的总DNA,能够扩增出392 bp特异性条带的为阳性转化植株。

    • TALENs载体遗传转化阳性植株的靶位点序列分析采用PCR扩增,然后测序分析。扩增引物(ITF: GCA GTG GCG GGA TAT GGT;ITR:ATC GTG TTG CTG GTT TGG)基于靶位点两侧序列设计。对于测序后确定的突变体,当靶位点序列缺失或插入4 bp以上时,后代追踪突变位点采用PCR结合聚丙烯酰胺凝胶(2%)电泳分析,而不是测序分析,以提高效率,减少费用。

    • IPA1是影响株型的重要基因,突变体的表型分析主要从株高、穗数、穗粒数、千粒重、穗长等方面考察表型。因穗数受环境影响较大,所以在突变体周围种植保护行,以尽量减少环境造成的误差。所有的田间调查数据都进行3次重复,并用DPS 7.05数据处理软件分析。

    • 为了准确利用基因组编辑技术编辑籼稻恢复系明恢86的理想株型基因IPA1,需要了解明恢86中IPA1基因序列信息。因此,利用PCR扩增明恢86背景下IPA1基因序列,测序后比对发现,明恢86中IPA1基因序列与日本晴的一致。

      依据相关文献[5-7],基因IPA1是水稻分蘖数的一个负调控因子,其表达序列区有一个miRNA156结合位点,该结合位点序列发生碱基替换突变时,基因IPA1的表达产物增加,引起水稻株型的变化。为了解该miRNA156结合位点区发生强突变对水稻株型的影响,本研究TALENs的靶位点选择在miRNA156结合的位点附近(图 1)。依据TALENs靶序列设计原则,本研究设计了2个TALENs靶位(表 1),分别利用这2个靶序列构建了相应的TALENs表达载体TIPA1-1和TIPA1-2,以期增加获得期望突变的概率。

      图  1  TALENs编辑水稻IPA1基因的靶位点

      Figure 1.  Target sites in rice IPA1 gene for TALENs editing

      表 1  基因编辑的靶位点序列

      Table 1.  Target sequence for gene-editing

      靶位点编号
      Target Num.
      靶位点序列
      Target sequences
      TIPA1-1 左臂Left arm:GCCGCCACCGACTCGAG
      右臂Right arm:TCCCATGGCTGGGTTGACA
      TIPA1-2 左臂Left arm:CGGTGCCGCCACCGACT
      右臂Right arm:GGGTTGACAGAAGAG
    • 将所构建的TALENs载体(TIPA1-1和TIPA1-2)分别经农杆菌介导转化水稻愈伤组织,获得转基因再生植株。PCR检测发现,不同的载体转基因后代的阳性克隆率有所不同。总的看TALENs载体的阳性克隆率较高,TIPA1-1和TIPA1-2的阳性克隆率分别为94.7%和85.1%(表 2图 2)。

      表 2  基因编辑再生植株阳性率及靶位点突变率

      Table 2.  Positive transgenic and mutation rates of target gene editing on plants

      载体名称
      Vector name
      再生克隆数 阳性克隆数 阳性率/% 突变克隆数 阳性克隆突变率/%
      TIPA1-1 38 36 94.7 2 5.6
      TIPA1-2 67 57 85.1 0 0.0
      注:再生克隆数Num. of regenerated clones,阳性克隆数Num. of positive clones,阳性率Positive percentage,突变克隆数Num. of mutation clones,阳性克隆突变率Mutation percentage of positive clones。

      图  2  基因编辑T0代阳性转基因植株筛选

      Figure 2.  Screening of gene-edited T0 mutant transgenic plants

    • 对TALENs载体获得T0代阳性转基因植株,用引物ITF/ITR扩增IPA1基因的靶位点区,测序发现TIPA1-1载体转基因阳性克隆中只有2个克隆的植株靶位点有突变,阳性植株突变率约5.6%;而TIPA1-2载体转基因后代中未检测到靶位点的突变(表 2)。进一步将TIPA1-1和TIPA1-2的抗性愈伤组织进行继代培养,连续继代后分化,结果发现:TIPA1-1新的再生植株中出现新突变(原来无突变克隆)或新的突变类型(原有突变克隆),并出现纯合突变和大片段缺失的类型;连续继代两代后即出现缺失16 bp的纯合突变和缺失180 bp的大片段缺失突变体。在TIPA1-1继代分化苗中筛选到31株突变体,突变类型有8种(图 3)。而在TIPA1-2继代分化苗中仍未筛选到靶位点突变植株,推测TIPA1-2的TALENs蛋白可能缺少活性。

      图  3  TALENs编辑基因IPA1的序列突变类型

      Figure 3.  Mutation types of IPA1 produced by TALENs

    • 将上述目标基因序列突变的T0代植株进行自交,获得T1代种子,种植成T1代植株。利用载体引物对这些T1代植株中的转基因成分进行PCR分析,筛选出不含转基因成分的T1代植株(图 4)。再利用测序(单碱基变异)或聚丙烯酰胺凝胶电泳(多碱基缺失或插入)对不含转基因成分植株中靶位点序列进行分析,获得不含外源转基因成分的纯合或杂合靶基因突变体(图 5)。进一步对纯合突变体的农艺性状进行选择可获得水稻新种质。

      图  4  不含转基因成分(TALENs载体成分)的T1植株筛选

      Figure 4.  Selection of T1 plants without transgenic (TALENs vector) components

      图  5  不含转基因成分的突变体筛选

      Figure 5.  Selection on mutants free of transgenic components

    • 选择不含外源转基因成分的3种突变体(缺失2、4、16 bp移码突变体)观察田间表型。田间调查结果发现,这3种突变体的表型变化一致,株高相对野生型显著降低,而分蘖数显著增多(图 6)。

      图  6  IPA1基因编辑突变体株型

      Figure 6.  Plant architectures of wild-type and IPA1 gene edited mutants

      对考种数据进行分析发现,IPA1基因突变能够显著改变水稻的株高、有效穗数、穗长及穗粒数。在明恢86遗传背景下,缺失移码突变体的株高为90.6~94.1 cm、有效穗数为14.4~16.5个·株-1、穗长为18.1~19.4 cm、穗粒数为113.2~122.7粒、结实率为79.20%~83.70%、千粒重为28.1~28.8 g。与野生型比较,突变体的株高降低7.9%~11.4%,有效穗数增加46.9%~68.4%,穗长变短24.2%~29.3%,穗粒数减少31%~34%,结实率和千粒重差异不明显(表 3)。由此可见,利用TALENs基因组编辑技术定点突变水稻IPA1基因能够明显改变水稻株高、有效穗数、穗长及穗粒数等性状,产生与野生型不同的水稻新株型。

      表 3  ipa1纯合突变体主要农艺性状

      Table 3.  Main agronomic traits of IPA1 mutants

      样品编号
      Sample NO.
      株高
      Plant height/cm
      有效穗数
      Effective panicle number
      穗长Average of panicle length/cm 穗粒数
      grains per panicle
      结实率
      SettingPercentage/%
      千粒重1000-grain weight/g
      ipa1-CK 102.2Aa 9.8A 25.6 A 178.2Aa 81.4a 28.3 a
      ipa1-2 90.6Bb 15.8C 19.3B 122.7Bb 79.20 a 28.1 a
      ipa1-4 90.7Bb 16.5C 19.4B 121.2Bb 83.70 a 28.6 a
      ipa1-16 94.1Bc 14.4B 18.1C 113.2Bc 82.50 a 28.8 a
      注:ipa1-CK为杂合突变体分离得到的野生型;ipa1-2、ipa1-4、ipa1-16分别为T2代缺失2、4、16 bp的纯合突变体。表中同列数据后无相同大、小写字母者分别表示同一性状不同样品材料之间差异达极显著水平(P < 0.01)和显著水平(P < 0.05)。
      Note:ipa1-CK is a wild-type from progeny of a heterozygous mutant; ipa1-2, ipa1-4, and ipa1-16 are T2 homozygous mutants with 2 bp, 4 bp, and 16 bp detection, respectively. Data in a same column with different capital letters indicate extremely significant differences (P < 0.01) and with different lowercase letters, significant differences (P < 0.05).
    • 20世纪90年代,Khush等提出水稻“新株型”(理想株型)概念,其特征是少分蘖、植株较矮、穗粒数较多、茎秆强壮、根系发达并抗多种病虫害等[18-19],但依此理念早期进行的水稻新株型育种实践效果并不理想[20-21]。水稻理想株型育种虽然进展缓慢,但有关理想株型相关基因的分子遗传学研究取得一系列重要进展,特别是围绕水稻理想株型关键基因IPA1的功能及调控机制研究[5-6, 22-24],为水稻理想株型育种注入了新的活力。本研究通过基因组编辑技术定向突变了IPA1基因,在优良恢复系明恢86的背景下创制了一批ipa1基因移码突变体,表型观察发现:其植株显著矮化,分蘖显著增多,穗粒数显著减少,是一些与理想株型特征完全不同的株型变异。

      目前生产上应用的每一种水稻株型都有缺陷,这是因为水稻产量构成因子(有效穗数、穗粒数和千粒重)间存在一定的负相关,增加水稻产量实质是它们彼此之间协调或折中的结果。早期的理想株型材料中,IPA1表达量增加,可显著增加穗粒数、但也显著减少了分蘖数,使得理想株型的增产效应并不明显[20-21]。对超级稻甬优12的最新研究发现,控制IPA1的表达水平可以适度调节理想株型性状,从而有可能获得理想产量[22]。当然,实际生产上应用的水稻品种产量形成的遗传机理要复杂得多,不仅仅是IPA1基因,也涉及其他相关基因及其互作效应[25-26]。本研究通过基因编辑突变IPA1基因后产生了一系列多穗型株型突变体,但这些突变体的产量效应,特别是与不同不育系配组后的杂种表现,以及与其他产量构成性状基因(如穗粒数基因、粒重基因等)的关系还有待进一步研究。

参考文献 (26)

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