• 中文核心期刊
  • CSCD来源期刊
  • 中国科技核心期刊
  • CA、CABI、ZR收录期刊

留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

兔源强毒力金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法的建立

王锦祥 孙世坤 陈岩锋 陈冬金 桑雷 谢喜平

王锦祥,孙世坤,陈岩锋,等. 兔源强毒力金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法的建立 [J]. 福建农业学报,2020,35(8):857−862 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2020.08.007
引用本文: 王锦祥,孙世坤,陈岩锋,等. 兔源强毒力金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法的建立 [J]. 福建农业学报,2020,35(8):857−862 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2020.08.007
WANG J X, SUN S K, CHEN Y F, et al. A Duplex PCR Assay for Simultaneously Detecting Two Virulent Strains of Staphylococcus aureus in Rabbits [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2020,35(8):857−862 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2020.08.007
Citation: WANG J X, SUN S K, CHEN Y F, et al. A Duplex PCR Assay for Simultaneously Detecting Two Virulent Strains of Staphylococcus aureus in Rabbits [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2020,35(8):857−862 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2020.08.007

兔源强毒力金黄色葡萄球菌双重PCR检测方法的建立

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2020.08.007
基金项目: 福建省科技计划公益类专项(2019R1026-9);国家兔产业技术体系建设专项(CARS-43-G-5)
详细信息
    作者简介:

    王锦祥(1983−),男,助理研究员,主要从事畜禽疫病防控技术研究(E-mail:wjx841227@126.com

    通讯作者:

    谢喜平(1966−),男,研究员,主要从事草食动物育种、饲养技术研究与示范推广(E-mail:xxp702@163.com

  • 中图分类号: S 852

A Duplex PCR Assay for Simultaneously Detecting Two Virulent Strains of Staphylococcus aureus in Rabbits

  • 摘要:   目的  建立检测兔源强毒力金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的双重PCR检测方法,为兔葡萄球菌病的诊断提供技术支持。  方法  根据兔源金黄色葡萄球菌的nucpvl两种毒力基因的保守序列分别设计了两对特异性引物进行双重PCR扩增,对双重PCR反应体系的混合引物浓度和退火温度进行优化,对双重PCR检测方法的特异性、敏感性和准确性进行验证。  结果  当双重PCR反应体系混合引物的浓度为0.6 μmol·L−1、退火温度为59.6 ℃时,双重PCR的扩增效果最优。该双重PCR检测方法特异性好,能扩增出兔源强毒力金黄色葡萄球菌的nuc(320 bp)和pvl(585 bp)基因片段以及低毒力菌株的nuc(320 bp)基因片段,对兔源多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎克雷伯菌和大肠杆菌等4种常见兔源细菌性病原菌以及阴性对照均无交叉反应。该方法敏感性高,能分别检出10 pg和100 fg的强毒力和低毒力兔源金黄色葡萄球菌基因组DNA。该方法重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均为0;该方法准确性好,对119份临床样品的检测结果与已报道的检测金黄色葡萄球菌nucpvl基因的单重PCR检测方法的符合率为100%。  结论  针对nucpvl两种毒力基因建立的双重PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性,为兔源强毒力金黄色葡萄球菌的检测提供了有效的技术支持。
  • 图  1  单重PCR扩增结果

    注:M:DNA Marker;1:强毒力菌株nuc基因;2:强毒力菌株pvl基因;3:低毒力菌株nuc基因;4:低毒力菌株pvl基因;5:阴性对照nuc基因;6:阴性对照pvl基因。

    Figure  1.  Result of single PCR amplification

    Note: M: DNA marker; 1: nuc of hyper-virulent strain; 2: pvl of hyper-virulent strain; 3: nuc of low-virulent strain; 4: pvl of low-virulent strain; 5: nuc of negative control; 6: pvl of negative control.

    图  2  双重PCR扩增结果

    注:M:DNA Marker;1:强毒力菌株;2:低毒力菌株;3:阴性对照。

    Figure  2.  Result of duplex PCR amplification

    Note: M: DNA marker; 1: hyper-virulent strain; 2: low-virulent strain; 3: negative control.

    图  3  双重PCR检测方法引物浓度优化

    注:A:强毒力菌株;B:低毒力菌株;M:DNA Marker;1~8表示引物浓度为0.2、0.3、0.4 、0.5、0.6、0.7、0.8 μmol·L−1

    Figure  3.  Optimization on primer concentration for duplex PCR assay

    Note: A: hyper-virulent strain; B: low-virulent strain; M: DNA marker; 1–8: primer concentration 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7 and 0.8 μmol·L−1.

    图  4  双重PCR检测方法退火温度优化

    注:A:强毒力菌株;B:低毒力菌株;M:DNA Marker;1~8表示退火温度53.0、53.5、54.4、55.8、57.5、58.8、59.6、60.0 ℃。

    Figure  4.  Optimization on annealing temperature for duplex PCR assay

    Note: A: hyper-virulent strain; B: low-virulent strain; M: DNA marker; 1–8: annealing temperature at 53, 53.5, 54.4, 55.8, 57.5, 58.8, 59.6 and 60 ℃.

    图  5  双重PCR检测方法特异性

    注:M:DNA Marker;1:强毒力菌株;2:低毒力菌株;3:多杀性巴氏杆菌;4:支气管败血波氏杆菌;5:肺炎克雷伯菌;6:大肠杆菌;7:阴性对照。

    Figure  5.  Specificity test of duplex PCR assay

    Note: M: DNA marker; 1: hypre-virulent strain; 2: low-virulent strain; 3: Pasteurella multocida; 4: Bordetella bronchiseptica; 5: Klebsiella pneumonia; 6: Escherichia coli; 7: negative control.

    图  6  双重PCR检测方法敏感性

    注:A:强毒力菌株;B:低毒力菌株;M:DNA Marker;1~9:100 ng、10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg。

    Figure  6.  Sensitivity test of duplex PCR assay

    Note: A: hyper-virulent strain; B: low-virulent strain; M: DNA marker; 1: 100 ng; 2: 10 ng; 3: 1 ng; 4: 100 pg; 5: 10 pg; 6: 1 pg; 7: 100 fg; 8: 10 fg; 9: 1 fg.

    表  1  双重PCR检测方法引物

    Table  1.   Primers for duplex PCR assay

    靶基因
    Target genes
    引物名称
    Primers
    引物序列(5′-3′)
    Primer sequences(5′-3′)
    产物大小
    Product size/bp
    nucnuc-Facttcaactaaaaaattacataaagaacct320
    nuc-Raagccttgacgaactaaagct
    pvlpvl-Fgcaacatcagattccgataagtta585
    pvl-Rggataacactggcattttgtga
    下载: 导出CSV

    表  2  临床样品的检测

    Table  2.   Detection of clinical samples

    样品
    Samples
    单重PCR检测结果
    Results of single PCR/份
    双重PCR检测结果
    Results of duplex PCR/份
    符合率
    Coincidence/%
    强毒力菌株 Hyper-virulent strain 30 30 100
    低毒力菌株 Low-virulent strain 45 45 100
    阴性 Negative 44 44 100
    总计 Control 119 119 100
    下载: 导出CSV
  • [1] 赵蕾, 李坤林, 李书光, 等. 长毛兔金黄色葡萄球菌的分离鉴定 [J]. 中国畜牧兽医, 2011, 38(9):184−186.

    ZHAO L, LI K L, LI S G, et al. Isolation and identification of a staphylococcus aureus from rabbit [J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2011, 38(9): 184−186.(in Chinese)
    [2] 王锦祥, 桑雷, 孙世坤, 等. 一株兔源金黄色葡萄球菌的分离和鉴定 [J]. 中国养兔, 2019(3):4−6. doi: 10.3969/j.issn.1005-6327.2019.03.001

    WANG J X, SANG L, SUN S K, et al. Isolation and identification of a Staphylococcus aureus from rabbit [J]. Chinese Journal of Rabbit Farming, 2019(3): 4−6.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1005-6327.2019.03.001
    [3] 王锦祥, 孙世坤, 陈岩峰, 等. 一株致兔皮下脓肿金黄色葡萄球菌的分离鉴定 [J]. 中国养兔, 2019(5):18−20. doi: 10.3969/j.issn.1005-6327.2019.05.004

    WANG J X, SUN S K, CHEN Y F, et al. Isolation and identification of a Staphylococcus aureus causing subcutaneous abscess in rabbit [J]. Chinese Journal of Rabbit Farming, 2019(5): 18−20.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1005-6327.2019.05.004
    [4] WANG J X, SANG L, CHEN Y F, et al. Characterisation of Staphylococcus aureus strain causing severe respiratory disease in rabbits [J]. World Rabbit Science, 2019, 27(1): 41−48. doi: 10.4995/wrs.2019.10454
    [5] 张国权, 孙乐天, 王国艳, 等. 獭兔源金黄色葡萄球菌16S rDNA鉴定与耐药性分析 [J]. 山西农业科学, 2018, 46(11):1926−1928, 1942. doi: 10.3969/j.issn.1002-2481.2018.11.36

    ZHANG G Q, SUN L T, WANG G Y, et al. Identification of 16S rDNA of Staphylococcus aureus from rex rabbits and analysis of drug resistance [J]. Journal of Shanxi Agricultural Sciences, 2018, 46(11): 1926−1928, 1942.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1002-2481.2018.11.36
    [6] WANG J, SANG L, SUN S, et al. Characterisation of Staphylococcus aureus isolated from rabbits in Fujian, China [J]. Epidemiology and Infection, 2019, 147: e256. doi: 10.1017/s0950268819001468
    [7] 邓钊宾, 余滔, 耿毅, 等. 兔源金黄色葡萄球菌的耐药性及耐药基因分析 [J]. 中国预防兽医学报, 2016, 38(1):45−48. doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2016.01.11

    DENG Z B, YU T, GENG Y, et al. Antibiotic resistance phenotype and genes detection of Staphylococcus aureus isolated from rabbit [J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine, 2016, 38(1): 45−48.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2016.01.11
    [8] BRAKSTAD O G, AASBAKK K, MAELAND J A. Detection of Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction amplification of the nuc gene [J]. Journal of Clinical Microbiology, 1992, 30(7): 1654−1660. doi: 10.1128/JCM.30.7.1654-1660.1992
    [9] LABANDEIRA-REY M, COUZON F, BOISSET S, et al. Staphylococcus aureus panton-valentine leukocidin causes necrotizing pneumonia [J]. Science, 2007, 315(5815): 1130−1133. doi: 10.1126/science.1137165
    [10] 向正刚, 耿毅, 张雨薇, 等. 四川兔源金黄色葡萄球菌毒力检测及分子分型 [J]. 华南农业大学学报, 2017, 38(4):62−68. doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2017.04.011

    XIANG Z G, GENG Y, ZHANG Y W, et al. Virulence detection and molecular typing of Staphylococcus aureus isolated from rabbit in Sichuan area [J]. Journal of South China Agricultural University, 2017, 38(4): 62−68.(in Chinese) doi: 10.7671/j.issn.1001-411X.2017.04.011
    [11] RAO Q, SHANG W L, HU X M, et al. Staphylococcus aureus ST121: a globally disseminated hypervirulent clone [J]. Journal of Medical Microbiology, 2015, 64(12): 1462−1473. doi: 10.1099/jmm.0.000185
  • 加载中
图(6) / 表(2)
计量
  • 文章访问数:  886
  • HTML全文浏览量:  292
  • PDF下载量:  12
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2020-05-21
  • 修回日期:  2020-07-30
  • 刊出日期:  2020-08-19

目录

    /

    返回文章
    返回