嗜水气单胞菌脂肪酸生物合成途径相关蛋白的耐药性

胡文杰; 张香玉; 吴倩; 林梅贵; 黄小芳; 林向民

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2017.01.001

嗜水气单胞菌脂肪酸生物合成途径相关蛋白的耐药性

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2017.01.001

胡文杰^{1, 2},
张香玉^{1, 2},
吴倩^{1, 2},
林梅贵^{1, 2},
黄小芳^{1, 2},
林向民^{1, 2, ,}

1.
福建农林大学生命科学学院, 福建福州 350002
2.
福建农林大学福建省农业生态过程与安全监控重点实验室, 福建福州 350002

基金项目:

国家自然科学基金项目 31200105

国家自然科学基金项目 31470238

详细信息

作者简介:
胡文杰 (1995-), 男, 主要从事蛋白质组学研究

通讯作者:
林向民 (1977-), 男, 博士生导师, 研究员, 主要从事蛋白质组学研究 (E-mail:xiangmin@fafu.edu.cn)

中图分类号: Q93
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出版历程
- 收稿日期: 2016-08-30
- 修回日期: 2016-10-20
- 刊出日期: 2017-01-01

Antibiotic-resistance Related to Proteins Associated with Fatty Acid Biosynthesis in Aeromonas hydrophila

HU Wen-jie^{1, 2},
ZHANG Xiang-yu^{1, 2},
WU Qian^{1, 2},
LIN Mei-gui^{1, 2},
HUANG Xiao-fang^{1, 2},
LIN Xiang-min^{1, 2
, ,}

1.
School of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China
2.
Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

摘要

摘要: 嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila是一种广泛存在于水体与土壤的人-畜-鱼共患病原菌。本课题组前期研究发现生物被膜状态下嗜水气单胞菌在抗生素金霉素的胁迫下，脂肪酸生物合成途径中相关蛋白表达上升，但具体特性与功能尚不明确。为进一步探究这些蛋白在抗生素胁迫下的变化规律与功能，设计引物克隆乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶α亚基（AccA）、乙酰辅酶A羧化酶羧基转移酶β亚基（AccD）、酰基载体蛋白质合成酶（FabB）以及丙二酸单酰辅酶A酰基载体蛋白酰基转移酶（FabD）。通过比较各高表达菌株在金霉素作用下的生存率，来分析相关蛋白的耐药特性。结果表明，高表达AccD、FabB和FabD蛋白能够显著提高细菌在抗生素胁迫下的生存率，而高表达AccA蛋白则只在前期提高细菌存活率。此研究揭示脂肪酸生物合成途径相关蛋白在细菌的耐药过程中起重要作用，也为后续研究嗜水气单胞菌的耐药机制提供了实验依据。
- 嗜水气单胞菌 /
- 脂肪酸生物合成 /
- 耐药性
Abstract: Widely exists in water and soil, Aeromonas hydrophila is a commonpathogen for human, livestock and fish. It was previously observed in our lab that the expression of the proteins associated with the fatty acid biosynthesis in A. hydrophilarose under the stress of chlortetracycline. But the specific properties and functions were not understood. Therefore, this study was designed to clone and express those potentially important proteins, including acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl transferase subunit alpha (AccA), acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl transferase subunit beta (AccD), 3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase Ⅰ (FabB), and malonyl coA-acyl carrier protein transacylase (FabD) for further investigation. By comparing the survival rates of high-expression strains of A. hydrophila under chlortetracycline stress, the drug-resistance relating to the proteinsin the fatty acid biosynthesispathway was analyzed. The results showed that the high-expression proteins, AccD, FabB and FabD, could indeed significantly increase the survival rate of the pathogen under chlortetracycline stress, while AccA did so only during the initial stage. Consequently, a critical role of these proteins involving the bacterial drug-resistance was clearly demonstrated. With the finding, further study to unveil the mechanism of antibiotic-resistance of the pathogen is in order.
- Aeromonas hydrophila /
- fatty acid biosynthesis /
- resistance

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图 1 accA、accD、fabB和fabD基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测

注：M为核酸分子量标准；1为accA；2为accD；3为fabB；4为fabD。图 2同。

Figure 1. Agarose gel electrophoresis analysis on PCR products of accA, accD, fabB and fabD genes

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图 2 accA、accD、fabB、fabD单克隆菌液PCR检测

Figure 2. Agarose gel electrophoresis analysis on monoclonal PCR products of accA, accD, fabB and fabD genes

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图 3 蛋白诱导表达产物SDS-PAGE

注：M为蛋白质分子量标准；1、4、6、9为未加IPTG诱导的对照CK；2为AccA；3为AccD；5为FabB；7、8为FabD。

Figure 3. SDS-PAGE analysis on induced products

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图 4 pET-accD、pET-fabB、pET-fabD提取质粒双酶切检测

注：①M为核酸分子量标准，1为accD，2为fabB，3为fabD；②酶切后的片段：accD为864 bp；fabB为1 212 bp；fabD为936 bp。

Figure 4. Double enzyme digestion of pET-accD, pET-fabB and pET-fabD plasmids

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图 5 AccA、AccD、FabB和FabD高表达后对细菌耐药性的影响

注：A为未加CTC处理的各菌株生长曲线；B为加80 μg·mL^-1CTC处理的各菌株生长曲线；C为8 h时各重组菌株生存率比较，Ⅰ为pET-32a，Ⅱ为EASY-AccA，Ⅲ为pET-AccD，Ⅳ为pET-FabB，Ⅴ为pET-FabD，P < 0.000 1。

Figure 5. Expression profiles of AccA, AccD, FabB and FabD proteinsunder treatments

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表 1 accA、accD、fabB和fabD原核表达引物

Table 1. Primers used for expressions of accA, accD, fabB and fabD

目的基因	引物	引物序列 (5′-3′)	退火温度/℃
accA	accA-F	CGCGGATCCATGAGTCTTTTTCTGGATTT (BamHI)	62.6
	accA-R	CAAGCTTTTAGCAGTAGCCGTAGCCCAG (HindⅢ)	65.4
accD	accD-F	CGGATCCATGAGCTGGCTTGAGAAGATC (BamHI)	65.4
	accD-R	CCAAGCTTTCACTCTTCGATGACGTGAGT (HindⅢ)	64
fabB	fabB-F	CGGATCCATGAGAAGAGCAGTGATCACCG (BamHI)	67.1
	fabB-R	CCAAGCTTTCAAGCCTTGAACTTGCTGAAC (HindⅢ)	70.3
fabD	fabD-F	CCGGAATTCATGACCCAATTTGCCATTGCCT (EcoRI)	65.4
	fabD-R	CCAAGCTTTTACTTGATCTGGGCCAGCGCCT (HindⅢ)	68
注：斜体部分为保护碱基，列表里下划线为酶切位点。

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