Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Three Duck Viral Diseases
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摘要: 为了一次性检测临床样品中是否存在鸭新城疫病毒（NDV）、鸭瘟病毒（DPV）或鸭坦布苏病毒（DTMUV）感染，本研究根据GenBank已登录的3种病原的保守基因序列，分别设计了3对特异性引物，通过优化扩增条件，建立了可同时检测NDV、DPV和DTMUV的多重PCR检测方法。特异性检验表明，该多重PCR方法可同时扩增出NDV（510 bp）、DPV（400 bp）、DTMUV（300 bp）的特异片段，对其他鸭常感染病毒扩增结果均为阴性；敏感性测定表明，该多重PCR技术最低能检出1.02×104拷贝·μL-1 NDV、3.50×103拷贝·μL-1 DPV和1.17×104拷贝·μL-1 DTMUV。采用建立的多重PCR方法对250份临床样品进行检测结果显示，其检测结果与该3种病毒的常规单一PCR检测结果符合率为100%。以上结果表明，本研究建立的多重PCR检测方法具有快速、特异性强、敏感性高等优点，适用于临床样品中上述3种病原的检测。Abstract: To simultaneously detect the presence of Newcastle disease virus (NDV), duck plague virus (DPV) and/or duck Tembusu virus (DTMUV) in ducks, 3 pairs of specific primers based on the conserved regions of the genomes of these viruses deposited in Gen Bank database were used for the development of a multiplex PCR assay method. The PCR reaction conditions were optimized, and specificity and sensitivity of the assay determined. The results showed that the new method could amplify the specific gene fragments of NDV at 510 bp, DPV at 400 bp, and DTMUV at 300 bp simultaneously without adulterations. The detection sensitivity of the assay was 1.02×104 copies·μL-1 on NDV, 3.50×103 copies·μL-1 on DPV, and 1.17×104 copies·μL-1 on DTMUV. The detection results were completely agreeable with those obtained by the conventional PCR method on 250 clinical samples. It appeared that the currently established methodology to simultaneously detect the 3 target viruses was rapid and convenient with high specificity and sensitivity.
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Key words:
- newcastle disease virus /
- duck plague virus /
- duck Tembusu virus /
- multiplex PCR
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图 1 多重PCR扩增结果
注：M为DNA Marker DL2000；1为NDV、DPV、DTMUV混合样品；2为NDV；3为DPV；4为DTMUV；5为阴性对照。
Figure 1. Amplification results of multiplex PCR assay
图 2 多重PCR特异性检测
注：M为DNA MarkerDL2000；1为NDV、DPV、DTMUV混合样品；2为NDV；3为DPV；4为DTMUV；5为MDRV；6为MDPV；7为DuCV；8为DHV；9为H9 AIV；10为阴性对照。
Figure 2. Specificity test on multiplex PCR assay
图 3 多重PCR敏感性试验
注：M为DNA分子量标准(DNA Marker)；1为8.20×104拷贝·μL-1 NDV，2.86×104拷贝·μL-1 DPV，9.38×104拷贝·μL-1 DTMUV；2为4.10×104拷贝·μL-1 NDV，1.43×104拷贝·μL-1 DPV，4.69×104拷贝·μL-1 DTMUV；3为2.05×104拷贝·μL-1 NDV，7.15×103拷贝·μL-1 DPV，2.34×104拷贝·μL-1 DTMUV；4为1.02×104拷贝·μL-1 NDV，3.50×103拷贝·μL-1 DPV，1.17×104拷贝·μL-1 DTMUV；5为5.15×103拷贝·μL-1 NDV，1.80×103拷贝·μL-1 DPV，5.85×103拷贝·μL-1 DTMUV；6为2.58×103拷贝·μL-1 NDV，9.00×102拷贝·μL-1 DPV，2.93×103拷贝·μL-1 DTMUV；7为阴性对照。
Figure 3. Sensitivity test on multiplex PCR assay
图 4 单一PCR与多重PCR单纯感染样品检测结果
注：M为DNA Marker DL2000；1、2为NDV样品单一PCR；3、4为NDV样品多重PCR；5、6为DPV样品单一PCR；7、8为DPV样品多重PCR；9、10为DTMUV样品单一PCR；11、12为DTMUV样品多重PCR。
Figure 4. Detections of individual virus by single and multiplex PCR assays
图 5 单一PCR与多重PCR混合感染样品检测结果
注：M为DNA Marker DL2000；1、3为NDV样品单一PCR；2、4为DTMUV样品单一PCR；5、6为NDV与DTMUV混合感染样品多重PCR。
Figure 5. Detections of 3 viruses by single and multiplex PCR assays
表 1 引物序列
Table 1. Sequences of primers
引物名称 引物序列(5′-3′) 目的片段/bp NDV-F TCCCAGYACCYYTGACMCTG 510 NDV-R CTGCCACTGCTAGTTGTGATAAT DPV-F TAGCGCATACTCGTTCTCCA 400 DPV-R TTACACACAGCGGTTGCAAG DTMUV-F TACTTGAGGCCAAGAATACG 300 DTMUV-R TTTGCCGTGATGGTCACACA 
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