湖北道地药材贝母ISSR反应体系优化及多态性引物筛选

蒋小刚; 王华; 郭坤元; 张美德

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2021.06.004

湖北道地药材贝母ISSR反应体系优化及多态性引物筛选

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.06.004

湖北省农业科学院中药材研究所/国家中药材产业技术体系恩施综合试验站/湖北省农业科技创新中心中药材分中心，湖北　恩施　445000

基金项目: 湖北省重点研发计划项目（2020BCA059）；湖北省农业科技创新中心2020年重大科技研发项目（2020-620-000-002-04）；国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-21）；第三批“湖北省青年英才开发计划”项目［鄂青联发（2020）1号］；湖北省农业科学院中药材研究所技术创新重大项目（2019ZYCZD01）；湖北省中央引导地方科技发展专项资金（2019ZYYD064）；湖北省技术创新专项（2019AKB092）；湖北省农业科学院青年科学基金（2021NKYJJ19）

详细信息

作者简介:
蒋小刚（1991−），男，硕士，研究方向：药用植物育种（E-mail：jxg154113@163.com）

通讯作者:
郭坤元（1986−），男，博士，助理研究员，研究方向：药用植物栽培与育种（E-mail：gtdrenhe@163.com）

中图分类号: S 682
计量
- 文章访问数: 474
- HTML全文浏览量: 154
- PDF下载量: 27
- 被引次数: 0
出版历程
- 收稿日期: 2020-08-23
- 修回日期: 2021-05-24
- 网络出版日期: 2021-06-06
- 刊出日期: 2021-06-28

ISSR Reaction Optimization and Primer Selection for Species Authentication of Fritillaria hupehensis Hsiao et K. C. Hsia

Institute of Chinese Medicinal Materials, Hubei Academy of Agricultural Sciences/Enshi Comprehensive Test Station, National Traditional Chinese Medicine Industry Technology System/Chinese Medicinal Materials Sub-center, Hubei Agricultural Science and Technology Innovation Center, Enshi, Hubei　445000, China

摘要

摘要: 目的优化湖北贝母ISSR-PCR体系，并筛选适用于湖北贝母的多态性引物，为后续湖北贝母的分子辅助育种及遗传多样性和亲缘关系分析等提供科学依据。方法采用U₁₂（4³）均匀设计和单因素试验结合的方法，获得PCR体系各组分（2×Taq Master Mix，模板 DNA，引物）的最佳用量，在此基础上通过梯度退火温度实验探究引物的最佳退火温度。结果湖北贝母ISSR-PCR最佳反应体系为：20 μL反应体系中，2×Taq Master Mix 10.5 μL，模板DNA 0.8 μL（40.0 ng），引物2.2 μL（5.5 μmol），ddH₂O 6.5 μL，ISSR-PCR扩增程序为: 94 ℃预变性5 min；94 ℃变性0.75 min，54.3 ℃～60.0 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.5 min，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用优化的反应体系筛选了6条多态性较好、扩增稳定的引物（UBC848、UBC850、UBC853、UBC857、UBC859、UBC866），其最佳退火温度分别为59.3、58.2、56.9、54.3、59.3和60.0 ℃。用优化的ISSR-PCR体系对12份不同产地的湖北贝母资源进行PCR扩增，结果表明，该反应体系稳定可靠，不同产地湖北贝母具有较丰富的遗传多样性。结论优化的湖北贝母ISSR-PCR反应体系可用于湖北贝母种质资源鉴定、亲缘关系和遗传多样性分析等研究。
- 湖北贝母 /
- ISSR /
- 分子标记 /
- 体系优化
Abstract: Objective The optimized ISSR-PCR reaction system and appropriate polymorphic primers were established to facilitate the authentication, breeding, and genetic studies on Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C. Hsia. Method A U₁₂(4³) uniform design method combined with a single factor screening test was employed to optimize the dosages of 2×Taq Master Mix, template DNA, and primer applied for ISSR-PCR and followed by a gradient temperature experiment to determine the primer annealing temperature. Result The optimal ISSR reaction system used 10.5 μL of 2×Taq Master Mix, 0.8 μL of template DNA (40.0 ng), 2.2 μL (2.5 μmol·L⁻¹) of primers, and 6.5 uL of ddH₂O for a 5 min sequencing at 94 ℃ and 40 cycles at 94 ℃ for 0.75 min, 54.3–60.0 ℃ for 0.75 min, and 72 ℃ for 1.5 min, followed by 10 min at 72 ℃ prior to storage at 4 ℃. Six stable polymorphic primers, UBC848, UBC850, UBC853, UBC857, UBC859, and UBC866 with the optimal annealing temperatures of 59.3, 58.2, 56.9, 54.3, 59.3, and 60.0 ℃, respectively, were selected. On 12 F. hupehensis germplasms from various locations, the optimized ISSR-PCR yielded stable and reliable results that showed abundant genetic diversity. Conclusion The optimized ISSR-PCR reaction system could be satisfactorily applied for the resource authentication and genetic analysis on F. hupehensis.
- Fritillaria hupehensis Hsiao et K. C. Hsia /
- ISSR /
- molecular marker /
- system optimization

HTML全文

图 1 12份湖北贝母基因组DNA电泳图

注：M：DL2000 DNA Marker；1～12：12份湖北贝母基因组DNA。

Figure 1. DNA electrophoretograms of 12 F. hupehensis germplasms

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-12: 12 genomic DNA of F. hupehensis germplasms.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 2 12份湖北贝母ITS₂扩增结果

注：M：DL2000 DNA Marker；1～12：12份ITS₂扩增结果。

Figure 2. ITS₂ amplifications on 12 F. hupehensis germplasms

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-12: 12 genomic DNA of F. hupehensis germplasms.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 3 ISSR-PCR均匀设计U₁₂（4³）扩增结果

注：M：DL2000 DNA Marker；1～12：表3的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 3. Results of U₁₂(4³) uniform design experiment for ISSR-PCR

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-12: same number codes as shown in Table 3; 3 replicates for each treatment.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 4 2×Taq Master mix单因素试验设计的ISSR-PCR

注：M：DL2000 DNA Marker；1～5：表4的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 4. ISSR-PCR of single factor screening test on 2×Taq Master Mix

Note: M: DL 2000DNA marker; 1-5: same number codes as shown in Table 4; 3 replicates for each treatment.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 5 模板DNA的单因素试验设计的ISSR-PCR

注：M：DL2000 DNA Marker；1～6：表5的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 5. ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

Note: M: DL2000 DNA marker; 1-6: same number codes as shown in Table 5; 3 replicates for each treatment.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 6 引物的单因素试验设计的ISSR-PCR

注：M：DL2000 DNA Marker；1～6：表6的处理编号，每个处理3个重复。

Figure 6. ISSR-PCR of single factor screening test on DNA

Note: M: DL2000DNA marker; 1-6: same number codes as shown in Table 6; 3 replicates for each treatment.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 7 引物UBC848不同退火温度扩增

注：M：DL2000 DNA Marker；1：60 ℃；2：59.3 ℃；3：58.2 ℃；4：56.4 ℃；5：54.3 ℃；6：52.7 ℃；7：51.6 ℃；8：51.0 ℃。

Figure 7. Amplification of primer UBC848 at different annealing temperatures

Note: M: DL2000DNA marker; 1: 60 ℃; 2: 59.3 ℃; 3: 58.2 ℃; 4: 56.4 ℃; 5: 54.3 ℃; 6: 52.7 ℃; 7: 51.6 ℃; 8: 51.0 ℃.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 8 引物 UBC866对12份湖北贝母资源的扩增结果

注：M：Super DNA Marker；1～12：12份湖北贝母资源。

Figure 8. Amplification results of 12 F. hupehensis germplasms by primer UBC866

Note: M: Super DNA marker; 1-12: 12 F. hupehensis germplasms.

下载: 全尺寸图片幻灯片

图 9 12份湖北贝母种质聚类分析

Figure 9. Cluster diagram of 12 F. hupehensis germplasms

下载: 全尺寸图片幻灯片

表 1 12份湖北贝母种质资源产地

Table 1. Producing areas of 12 F. hupehensis germplasms

编号 No.	产地 Producing area
FH1	恩施市新塘乡 Xintang Township, Enshi City
FH2	恩施市华中药用植物园 Huazhong Medicinal Botanical Garden, Enshi City
FH3	恩施市板桥镇 Banqiao Town, Enshi City
FH4	恩施市龙凤坝镇 Longfengba Town, Enshi City
FH5	建始县花坪镇 Huaping Town, Jianshi County
FH6	建始县龙坪乡 Longping Township, Jianshi County
FH7	建始县官店镇 Guandian Town, Jianshi County
FH8	建始县高坪镇 Gaoping Town, Jianshi County
FH9	利川市团堡镇 Tuanbao Town, Lichuan City
FH10	利川市汪营镇 Wangying Town, Lichuan City
FH11	利川市元堡乡 Yuanbao Township, Lichuan City
FH12	重庆市奉节县 Fengjie County, Chongqing City

下载: 导出CSV

表 2 ISSR-PCR体系均匀设计U₁₂（4³）

Table 2. U₁₂(4³) uniform design for ISSR-PCR （单位: μL）

水平 Level	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix
1	0.5	0.5	9.5
2	1.0	1.0	10.0
3	1.5	1.5	10.5
4	2.0	2.0	11.0

下载: 导出CSV

表 3 ISSR-PCR均匀设计U₁₂（4³）

Table 3. Mixed uniform design U₁₂（4³）for ISSR-PCR

（单位: μL）
编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	1.5	2.0	9.5	7.0
2	2.0	1.0	10.0	7.0
3	1.0	2.0	11.0	6.0
4	2.0	0.5	9.5	8.0
5	1.5	0.5	10.5	7.5
6	0.5	2.0	10.0	7.5
7	0.5	1.0	10.5	8.0
8	1.0	1.0	9.5	8.5
9	1.5	1.5	10.0	7.0
10	1.0	1.5	10.5	7.0
11	2.0	1.5	11.0	5.5
12	0.5	0.5	11.0	8.0

下载: 导出CSV

表 4 2×Taq Master mix的单因素试验设计

Table 4. Single factor screening test on 2×Taq Master Mix

（单位: μL）
编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	0.5	2.0	9.0	8.5
2	0.5	2.0	9.5	8.0
3	0.5	2.0	10.0	7.5
4	0.5	2.0	10.5	7.0
5	0.5	2.0	11.0	6.5

下载: 导出CSV

表 5 模板DNA的单因素试验设计

Table 5. Single factor screening test on DNA （单位: μL）

编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	0.2	2.0	10.5	7.3
2	0.5	2.0	10.5	7.0
3	0.8	2.0	10.5	6.7
4	1.0	2.0	10.5	6.5
5	1.5	2.0	10.5	6.0
6	2.0	2.0	10.5	5.5

下载: 导出CSV

表 6 引物的单因素试验设计

Table 6. Single factor screening test on primers （单位：μL）

编号 No.	模板DNA Template DNA	引物 Primers	2×Taq Master mix	ddH₂O
1	0.8	1.2	10.5	7.5
2	0.8	1.5	10.5	7.2
3	0.8	1.8	10.5	6.9
4	0.8	2.0	10.5	6.7
5	0.8	2.2	10.5	6.5
6	0.8	2.5	10.5	6.2

下载: 导出CSV

表 7 ISSR引物最佳退火温度

Table 7. Optimum primer annealing temperature

引物名称 Primer names	序列 Sequence	引物长度 Primer length/ bp	退火温度 Theoretical annealing temperature/ ℃	最佳退火温度 The optimum annealing temperature/ ℃
UBC848	C（AC）₇ARg	18	56.2	59.3
UBC850	（gT）₈YC	18	56.2	58.2
UBC853	（TC）₈RT	18	53.9	56.9
UBC857	（AC）₈Yg	18	56.2	54.3
UBC859	（Tg）₈RC	18	56.2	59.3
UBC866	（CTC）₅	15	56.3	60.0

下载: 导出CSV

表 8 12份湖北贝母遗传相似系数

Table 8. Genetic similarity coefficients of 12 F. hupehensis germplasms

编号 No.	FH1	FH2	FH3	FH4	FH5	FH6	FH7	FH8	FH9	FH10	FH11	FH12
FH1	1.0000
FH2	0.9143	1.0000
FH3	0.9143	0.8857	1.0000
FH4	0.7714	0.7429	0.8571	1.0000
FH5	0.9143	0.8857	0.9429	0.8000	1.0000
FH6	0.8571	0.8857	0.8857	0.7429	0.9429	1.0000
FH7	0.8857	0.9143	0.9143	0.7714	0.9143	0.9143	1.0000
FH8	0.7143	0.6857	0.7429	0.8286	0.7429	0.7429	0.7143	1.0000
FH9	0.7429	0.7714	0.7143	0.7429	0.7143	0.7714	0.7429	0.8000	1.0000
FH10	0.7143	0.6286	0.7429	0.8286	0.6857	0.6286	0.6571	0.7143	0.6286	1.0000
FH11	0.8286	0.7429	0.7429	0.6000	0.8000	0.7429	0.7714	0.5429	0.5714	0.5429	1.0000
FH12	0.9429	0.8571	0.9143	0.7714	0.9143	0.8571	0.8857	0.7143	0.7429	0.7143	0.7714	1.0000

下载: 导出CSV

参考文献(25)

[1]	陈虞超, 郭生虎, 关雅静, 等. 贝母属药用植物研究进展 [J]. 分子植物育种, 2019, 17(18):6198−6206. CHEN Y C, GUO S H, GUAN Y J, et al. The research progress of medicinal plants Fritillaria [J]. Molecular Plant Breeding, 2019, 17(18): 6198−6206.(in Chinese)
[2]	万军梅. 湖北贝母研究新进展 [J]. 福建茶叶, 2019, 41(7):8. doi: 10.3969/j.issn.1005-2291.2019.07.004 WAN J M. New research progress of Fritillaria hupehensis Hsiao et K.C. Hsia [J]. Tea in Fujian, 2019, 41(7): 8.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1005-2291.2019.07.004
[3]	牛换云, 余河水, 金施施, 等. 湖北贝母体外抑菌活性研究 [J]. 辽宁中医药大学学报, 2016, 18(1):62−64. NIU H Y, YU H S, JIN S S, et al. Study on the antibacterial activity in vitro of Hubei Fritillaria [J]. Journal of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2016, 18(1): 62−64.(in Chinese)
[4]	张勇慧, 阮汉利, 皮慧芳, 等. 湖北贝母生物碱单体的镇咳、祛痰和平喘作用 [J]. 中草药, 2005, 36(8):1205−1207. doi: 10.3321/j.issn:0253-2670.2005.08.037 ZHANG Y H, RUAN H L, PI H F, et al. Antitussive, expectorant and antiasthmatic effects of alkaloids from Fritillaria hupehensis [J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2005, 36(8): 1205−1207.(in Chinese) doi: 10.3321/j.issn:0253-2670.2005.08.037
[5]	朱利霞, 汪旭, 张汉扬, 等. 湖北贝母药材的质量标准研究 [J]. 中华中医药学刊, 2017, 35(4):838−842, 3. ZHU L X, WANG X, ZHANG H Y, et al. Study on quality standards of fritillariae hupehensis Bulbus [J]. Chinese Archives of Traditional Chinese Medicine, 2017, 35(4): 838−842, 3.(in Chinese)
[6]	徐仿周, 张鹏, 张勇慧, 等. 湖北贝母总生物碱平喘作用及其机理的研究 [J]. 时珍国医国药, 2009, 20(6):1335−1337. doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2009.06.019 XU F Z, ZHANG P, ZHANG Y H, et al. Studies on the antiasthmatic effect and mechanisms of the total alkaloids from Fritillaria hupehensis in guinea pigs [J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2009, 20(6): 1335−1337.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1008-0805.2009.06.019
[7]	牛换云, 金施施, 贾宇平, 等. 湖北贝母与紫花鄂北贝母中4种生物碱的含量比较分析 [J]. 中药材, 2015, 38(10):2105−2108. NIU H Y, JIN S S, JIA Y P, et al. Comparative analysis of content of four alkaloids in Fritillaria hupehensis and Fritillaria ebeiensis var.purpurea [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2015, 38(10): 2105−2108.(in Chinese)
[8]	黄夕洋, 唐辉, 孔德鑫, 等. 广西甜茶ISSR-PCR反应条件的建立与优化 [J]. 基因组学与应用生物学, 2013, 32(4):526−532. HUANG X Y, TANG H, KONG D X, et al. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction conditions in Rubus suavis simus S. lee [J]. Genomics and Applied Biology, 2013, 32(4): 526−532.(in Chinese)
[9]	巨秀婷, 阿啟兰, 侯志强, 等. 基于ISSR分子标记的郁金香品种遗传多样性分析 [J]. 基因组学与应用生物学, 2017, 36(7):2934−2939. JU X T, A Q L, HOU Z Q, et al. Genetic diversity analysis of tulip varieties based on ISSR markers [J]. Genomics and Applied Biology, 2017, 36(7): 2934−2939.(in Chinese)
[10]	余志雄, 陈明贤, 袁亚芳, 等. 火龙果ISSR优化体系的建立 [J]. 福建农业学报, 2010, 25(6):711−715. doi: 10.3969/j.issn.1008-0384.2010.06.011 YU Z X, CHEN M X, YUAN Y F, et al. Optimization of ISSR reaetion system in pitaya [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2010, 25(6): 711−715.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1008-0384.2010.06.011
[11]	袁亚芳, 陈明贤, 陈清西, 等. 福建地区火龙果种质资源调查及ISSR分析 [J]. 中国农学通报, 2013, 29(34):216−220. doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.2013-0980 YUAN Y F, CHEN M X, CHEN Q X, et al. Investigate and ISSR analysis of Pitaya germplasm resources in Fujian Province [J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2013, 29(34): 216−220.(in Chinese) doi: 10.11924/j.issn.1000-6850.2013-0980
[12]	张立杰, 李韬, 魏秀清, 等. 正交设计优化莲雾ISSR-PCR反应体系 [J]. 福建农业学报, 2012, 27(4):343−349. doi: 10.3969/j.issn.1008-0384.2012.04.006 ZHANG L J, LI T, WEI X Q, et al. ISSR-PCR optimization for waxapple (Syzygium samarangense) [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2012, 27(4): 343−349.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1008-0384.2012.04.006
[13]	何桥, 梁国鲁, 谢江辉, 等. 莲雾种质资源遗传多样性的ISSR分析 [J]. 园艺学报, 2006(2):392−394. doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.2006.02.035 HE Q, LIANG G L, XIE J H, et al. Genetic diversity analysis of wax apple germplasm by ISSR markers [J]. Acta Horticulturae Sinica, 2006(2): 392−394.(in Chinese) doi: 10.3321/j.issn:0513-353X.2006.02.035
[14]	卢超, 何银生, 艾伦强, 等. 道地药材咸丰白术ISSR反应体系优化及多态性引物筛选 [J]. 分子植物育种, 2018, 16(22):7423−7428. LU C, HE Y S, AI L Q, et al. Optimization of ISSR reaction and primer screening for genuine medicinal materials Xian-Feng Atractylodes macrocephala koidz [J]. Molecular Plant Breeding, 2018, 16(22): 7423−7428.(in Chinese)
[15]	段媛媛, 罗孝荣, 周武先, 等. 淫羊藿ISSR-PCR反应体系的建立与优化 [J]. 分子植物育种, 2020, 18(2):482−487. DUAN Y Y, LUO X R, ZHOU W X, et al. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system of Epimedium brevicornu maxim [J]. Molecular Plant Breeding, 2020, 18(2): 482−487.(in Chinese)
[16]	王卫, 陈义挺, 陈婷, 等. 均匀设计优化猕猴桃SRAP体系 [J]. 福建农林大学学报(自然科学版), 2013, 42(1):23−28. WANG W, CHEN Y T, CHEN T, et al. Uniform design optimization of SRAP-PCR system in Actinidia chinensis [J]. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University (Natural Science Edition), 2013, 42(1): 23−28.(in Chinese)
[17]	段媛媛, 游景茂, 周武先, 等. 两种不同种植模式下湖北贝母生长调查及性状构成分析 [J]. 中药材, 2019, 42(1):13−17. DUAN Y Y, YOU J M, ZHOU W X, et al. Growth investigation and character composition analysis of Fritillaria hupehensis under two different planting patterns [J]. Journal of Chinese Medicinal Materials, 2019, 42(1): 13−17.(in Chinese)
[18]	方开泰, 马长兴. 正交与均匀试验设计[M]. 北京: 科学出版社, 2001.
[19]	经建永, 陈曦, 马百强, 等. 新疆野生欧洲李ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J]. 分子植物育种, 2020, http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20200305.2146.021.html. JING J Y, CHEN X, MA B Q, et al. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system in Xinjiang Prunus domestica L[J]. Molecular Plant Breeding, http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20200305.2146.021.html.
[20]	丁雯, 李泽, 杜晨晖, 等. 酸枣仁ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选[J]. 分子植物育种, 2020: 1-8, http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20200212.1645.008.html. DING W, LI Z, DU C H, et al. Optimization and primers screening of ISSR-PCR reaction system for Ziziphi Spinosae Semen[J]. Molecular Plant Breeding, 2020: 1-8[2020-07-23]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20200212.164508.html.
[21]	郭傲, 高欢欢, 陈默, 等. 无花果ISSR-PCR反应体系的建立与优化[J/OL]. 分子植物育种: 1-11[2020-09-22]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20200804.1928.014.html. GUO A, GAO H H, CHEN M, et al. Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system for Ficus carica[J]. Molecular Plant Breeding: 1-11[2020-09-22]. http://kns.cnki.net/kcms/detail/46.1068.S.20200804.1928.014.html.
[22]	刘红艳, 杨东, 张繁荣, 等. 鱇浪白鱼ISSR-PCR最佳退火温度的筛选 [J]. 江汉大学学报(自然科学版), 2010, 38(1):70−73. LIU H Y, YANG D, ZHANG F R, et al. Screening for optimum annealing temperature of ISSR-PCR primers of Anabarilius grahami [J]. Journal of Jianghan University, 2010, 38(1): 70−73.(in Chinese)
[23]	闫林, 黄丽芳, 谭乐和, 等. 咖啡ISSR与RAPD-PCR反应体系优化 [J]. 热带作物学报, 2012, 33(5):854−859. YAN L, HUANG L F, TAN L H, et al. Optimization of RAPD and ISSR-PCR reaction systems for coffee [J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2012, 33(5): 854−859.(in Chinese)
[24]	黎开强, 吴卫, 郑有良, 等. 川产贝母种质资源遗传多样性的ISSR分析 [J]. 中国中药杂志, 2009, 34(17):2149−2154. doi: 10.3321/j.issn:1001-5302.2009.17.004 LI K Q, WU W, ZHENG Y L, et al. ISSR analysis on genetic diversity of Fritillaria germplasm resources from Sichuan [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2009, 34(17): 2149−2154.(in Chinese) doi: 10.3321/j.issn:1001-5302.2009.17.004
[25]	詹羽姣, 盛萍, 姚蓝, 等. 新疆贝母属8种药用贝母遗传多样性ISSR分析 [J]. 中国野生植物资源, 2015, 34(4):1−6. doi: 10.3969/j.issn.1006-9690.2015.04.001 ZHAN Y J, SHENG P, YAO L, et al. ISSR analysis on genetic diversity of 8 species of plants in Fritillaria L. from Xinjiang [J]. Chinese Wild Plant Resources, 2015, 34(4): 1−6.(in Chinese) doi: 10.3969/j.issn.1006-9690.2015.04.001