番鸭源鸭疫里默氏杆菌的耐药性及<i>rpo</i><i>B</i>基因突变分析

林彬彬; 谢碧林; 王秀祯; 翁汉东; 程龙飞; 傅光华; 刘荣昌; 林志敏

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2021.11.011

番鸭源鸭疫里默氏杆菌的耐药性及rpoB基因突变分析

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2021.11.011

1.
莆田市农业科学研究所, 福建　莆田　351144
2.
福建省农业科学院畜牧兽医研究所, 福建　福州　350013

基金项目: 福建省科技计划引导性项目（2019N0038）

详细信息

作者简介:
林彬彬（1986−），女，硕士，助理研究员，研究方向：家禽疫病的诊断与防治研究（E-mail: lbbinz@163.com）

通讯作者:
林志敏（1967−），男，副研究员，研究方向：家禽疫病的诊断与防治研究（E-mail: ptlzm@126.com）

中图分类号: S 852.61
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出版历程
- 收稿日期: 2021-07-15
- 修回日期: 2021-09-13
- 网络出版日期: 2021-12-30
- 刊出日期: 2021-11-28

Drug Resistance and rpoB Gene Mutation of Riemerella anatipestifer Isolated from Diseased Muscovy Ducks

1.
Putian Institute of Agricultural Sciences, Putian, Fujian　351144, China
2.
Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian　350013, China

摘要

摘要: 目的了解福建省莆田市番鸭源鸭疫里默氏杆菌的耐药性及rpoB基因突变情况。方法无菌采集病死番鸭的脑、心脏、肝脏进行细菌分离纯化，提取分离株基因组DNA，利用16S rDNA基因特异性引物进行PCR鉴定，纸片法进行药敏试验，扩增并分析rpoB基因利福平耐药决定区序列。结果共分离到49株鸭疫里默氏杆菌，这些菌株均表现广谱耐药性，耐药谱介于11～21种药物，分离株对氨基糖苷类、大环内酯类、复方新诺明、多黏菌素B和利福平等药物的耐药性高，对四环素类、β-内酰胺类和氟苯尼考等药物的敏感性高。44株利福平耐药菌的rpoB基因出现R494K（43/44）单点突变和R494K和V382I（1/44）的双点突变，R494K单点突变也在1株利福平敏感菌中发现。结论近期防治鸭传染性浆膜炎可首选四环素类、β-内酰胺类和氟苯尼考等药物，利福平耐药决定区氨基酸的R494K单点突变可能是鸭疫里默氏杆菌对利福平耐药的主要机制之一。
- 鸭疫里默氏杆菌 /
- 分离 /
- 鉴定 /
- 耐药性 /
- rpoB基因
Abstract: Objective Drug resistance and rpoB gene mutation of Riemerella anatipestifer isolated from diseased Muscovy ducks in Putian, Fujian were studied. Method Brain, heart, and liver tissues were aseptically collected from the dead Muscovy ducks that were infected by the disease for isolation, identification, and drug resistance of the pathogen. The genomic DNA of the isolated strains were extracted and the 16S rDNA gene specific primers used for PCR identification. The disk method was applied to test the drug sensitivity of the isolates. The rifampicin resisting region in the rpoB gene was amplified and analyzed. Result Forty-nine strains of R. anatipestifer were isolated to show a broad-spectrum resistance to 11 to 21 kinds of drug, such as, aminoglycosides, macrolides, compound sulfamethoxazole, polymyxin B and rifampicin. But they were highly sensitive to tetracyclines, β-lactams, and florfenicol. In the rpoB gene of 44 rifampicin-resistant strains, a single point mutation, R494K(43/44), and two double point mutations, R494K and V382I (1/44), were found. R494K also existed in one rifampicin sensitive strain. Conclusion It appeared that tetracyclines, β-Lactams, and florfenicol could be the first choice for preventing and treating duck infectious serositis. The single point amino acid mutation location of R494K in the region that determines the rifampicin-resistance could harbor the key to unlocking the mechanisms of the drug resistance of R. anatipestifer.
- Riemerella anatipestifer /
- isolation /
- identification /
- drug resistance /
- rpoB gene

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图 1 鸭疫里默氏杆菌的16S rDNA扩增结果

注：M：DNA Marker DL2000；1～19：16S rDNA扩增产物；20：空白对照（ddH₂O）。

Figure 1. Electrophoretogram of 16S rDNA amplification of R. anatipestifer

Note: M: DNA marker DL2000; 1-19: 16S rDNA amplification products; 20: blank control (ddH₂O).

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表 1 引物序列及相关参数

Table 1. Primer sequence and related parameters

引物 Primers	引物序列（5′-3′） Sequence（5′-3′）	退火温度 Tm/℃	长度 Length/bp	参考文献 Reference
16S rDNA-F	CTTCGGATACTTGAGAGCG	54	960	[9]
16S rDNA-R	GCAGCACCTTGAAAATTGT	54	960	[9]
rpoB-F	AGACCCTACCAACTCA	50	783	[7]
rpoB-R	TCCTCATCTTCTGCGT	50	783	[7]

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表 2 49株鸭疫里默氏杆菌分离株对28种抗菌药物的药敏试验结果

Table 2. Test results on drug sensitivity of 49 R. anatipestifer isolates to 28 antibiotics %

抗菌药物种类　　　　 Types of antibiotics	药物名称　　 Drug name	耐药菌株比例 Proportion of drug resistant strains	中介菌株比例 Proportion of intermediate strains	敏感菌株比例 Proportion of sensitive strains
β-内酰胺类 β-Lactams	青霉素 G Penicillin G	20.41（10/49）	10.20（5/49）	69.39（34/49）
	氨苄西林 Ampicillin	20.41（10/49）	12.24（6/49）	67.35（33/49）
	阿莫西林 Amoxicillin	12.24（6/49）	12.24（6/49）	75.51（37/49）
	头孢唑林 Cefazolin	2.04（1/49）	2.04（1/49）	95.92（47/49）
	头孢曲松 Cefatriaxone	0.00（0/0）	2.04（1/49）	97.96（4849）
	头孢西丁 Cefoxitin	2.04（1/49）	0.00（0/0）	97.96（48/49）
	头孢他啶 Ceftazidime	2.04（1/49）	2.04（1/49）	95.92（47/49）
	头孢克肟 Cefixime	2.04（1/49）	0.00（0/0）	97.96（48/49）
	头孢吡肟 Cefepime	2.04（1/49）	0.00（0/0）	97.96（48/49）
氨基糖苷类 Aminoglycosides	链霉素 Streptomycin	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
	庆大霉素 Gentamicin	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
	卡那霉素 Kanamycin	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
	阿米卡星 Amikacin	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
	新霉素 Neomycin	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
四环素类 Tetracyclines	四环素 Tetracycline	2.04（1/49）	8.16（4/49）	89.80（44/49）
四环素类 Tetracyclines	强力霉素 Doxycycline	0.00（0/0）	0.00（0/0）	100.00（49/49）
大环内脂类 Macrolides	红霉素 Erythromycin	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
大环内脂类 Macrolides	阿奇霉素 Azithromycin	89.80（44/49）	6.12（3/49）	4.08（2/49）
喹诺酮类 Quinolones	恩诺沙星 Enrofloxacin	67.35（33/49）	26.53（13/49）	6.12（3/49）
	环丙沙星 Ciprofloxacin	59.18（29/49）	30.61（15/49）	10.20（5/49）
	氧氟沙星 Ofloxacin	8.16（4/49）	2.04（1/49）	89.80（44/49）
	诺氟沙星 Norfloxacin	81.63（40/49）	12.24（6/49）	6.12（3/49）
	萘啶酸 Nalidixic acid	24.49（12/49）	32.65（16/49）	42.86（21/49）
	吡哌酸 Pipemidic Acid	95.92（47/49）	2.04（1/49）	2.04（1/49）
磺胺类 Sulfonamides	复方新诺明 SMZ-TMP	100.00（49/49）	0.00（0/0）	0.00（0/0）
多肽类 Polypeptides	多黏菌素 BPolymyxin B	91.84（45/49）	4.08（2/49）	4.08（2/49）
酰胺醇类 Amphenicols	氟苯尼考 Florfenicol	2.04（1/49）	0.00（0/0）	97.96（48/49）
利福霉素类 Rifamycins	利福平 Rifampicin	89.80（44/49）	0.00（0/0）	10.20（5/49）

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表 3 49株鸭疫里默氏杆菌分离株的多重耐药性

Table 3. Multidrug resistance of 49 R. anatipestifer isolates

抗菌药物数量 Antibiotics amount	耐药菌株数量 Drug resistance amount/株	耐药率 Drug resistance rate/%
11耐 11 resistance	1	2.04
12耐 12 resistance	9	18.37
13耐 13 resistance	17	34.69
14耐 14 resistance	13	26.53
15耐 15 resistance	4	8.16
16耐 16 resistance	1	2.04
17耐 17 resistance	2	4.08
18耐 18 resistance	1	2.04
21耐 21 resistance	1	2.04

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表 4 49株鸭疫里默氏杆菌耐药株rpoB基因突变位置

Table 4. Mutation locations of rpoB gene in 49 resistant strains of R. anatipestifer

核苷酸突变 Nucleotide mutation	氨基酸突变 Amino acid mutation	突变率 Mutation rate/%	耐药菌株数 Resistance strain amount	敏感菌株数 Sensitive strain amount
GTA→ATA、AGA→AAA	V382I、 R494K	2.04（1/49）	1	0
CAT→AAT	H491N	8.16（4/49）	0	4
AGA→AAA	R494K	89.80（44/49）	43	1
注：V：缬氨酸（Val）；I：异亮氨酸（Ile）；H：组氨酸（His）；N：天冬酰胺（Asn）；R：精氨酸（Arg）；K：赖氨酸（Lys）。 Note: V: valine (Val); I: isoleucine (Ile); H: histidine (His); N: asparagine (Asn); R: arginine (Arg); K: lycine (Lys).

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