滇水金凤<i>4CL</i>基因的克隆及表达分析

陈心仪; 吴成英; 贺海皓; 黄海泉; 瞿素萍; 黄美娟

doi:10.19303/j.issn.1008-0384.2024.01.006

滇水金凤4CL基因的克隆及表达分析

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2024.01.006

1.
西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心，云南　昆明 650224
2.
云南省农业科学院花卉研究所，云南　昆明 650205

基金项目: 云南省重大科技专项（202102AE090052）；国家自然科学基金项目（32060364、32060366、 31860230）；云南省园林植物遗传改良与高效繁育博士生导师团队项目基金（503210103）

详细信息

作者简介:
陈心仪（1998 —），女，硕士研究生，主要从事风景园林植物资源与应用方向研究，E-mail：rhz1230@163.com

通讯作者:
瞿素萍（1972 —），女，研究员，主要从事花卉相关研究，E-mail：1035496319@qq.com

黄美娟（1972 —），女，博士，教授，主要从事园林植物方向研究，E-mail：xmhhq2001@163.com

中图分类号: S681.1
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出版历程
- 收稿日期: 2023-07-12
- 修回日期: 2023-11-27
- 网络出版日期: 2024-01-25
- 刊出日期: 2024-01-28

Cloning and Expression of 4CLs in Impatiens uliginosa

1.
College of Landscape Architecture and Horticulture Sciences, Southwest Forestry University/Southwest Landscape Architecture Engineering Technology Research Center, State Forestry and Grassland Administration/Yunnan Engineering Research Center for Functional Flower Resources and Industrialization/Research and Development Center of Landscape Plants and Horticulture Flowers, Southwest Forestry University, Kunming, Yunnan　650224, China
2.
Flower Research Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming, Yunnan　650205, China

摘要

摘要: 目的 4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）作为苯丙烷类代谢途径的关键酶之一，对花青素合成起着重要作用。探究滇水金凤4CL基因（命名为Iu4CL）对滇水金凤花色调控的分子机理，为其花色调控及花色育种提供参考依据。方法以滇水金凤为材料，采用RT-PCR技术分离克隆Iu4CL1、Iu4CL2、Iu4CL3和Iu4CL4基因，并对其生物信息学进行分析；通过qRT-PCR技术对4CL基因在4种不同花色（白色、粉色、红色和深红色）及其4个不同花发育时期（花苞期S1、始花期S2、盛花期S3和谢花期S4）中的表达情况进行分析。结果 Iu4CL1、Iu4CL2、Iu4CL3和Iu4CL4的cDNA全长分别为1620、1653、1698、1638 bp，分别编码539、550、565、545个氨基酸；其中Iu4CL1和Iu4CL2分别含有2个和4个内含子，Iu4CL3和Iu4CL4没有内含子。生物信息学分析表明，Iu4CL1、Iu4CL2和Iu4CL4为稳定蛋白，Iu4CL3为不稳定蛋白；4个基因均为无信号肽疏水性蛋白；Iu4CL2有3个跨膜结构，其余3个基因均不存在跨膜结构；Iu4CL基因4个拷贝均属于AMP结合酶超级家族和腺苷酸形成域I类超级家族。同源性分析表明，Iu4CL基因的4个拷贝均与喜马拉雅凤仙花的同源性最高；且Iu4CL1和Iu4CL2处于同一个大的分支中，而Iu4CL3和Iu4CL4处于另一个大的分支中，推测可能为旁系同源。qRT-PCR分析表明，Iu4CL基因的4个拷贝在4种不同花色和4个不同花发育时期的滇水金凤花器官中均有表达，其中Iu4CL1和Iu4CL3基因在白色花器官S3（盛花期）阶段表达量最高；Iu4CL2基因在红色花器官S3（盛花期）阶段表达量达到顶峰；Iu4CL4基因在深红色花器官S3（盛花期）阶段表达量最高。结论 Iu4CL基因可能在滇水金凤花青素生物合成中发挥重要作用。
- 滇水金凤 /
- 4CL基因 /
- 花色 /
- 基因克隆 /
- 表达分析
Abstract: Objective Genes of the enzyme in the phenylpropane metabolic pathway associated with anthocyanin synthesis of Impatiens uliginosa were studied for breeding purposes. Method RT-PCR was employed to isolate and clone Iu4CL1,Iu4CL2, Iu4CL3, and Iu4CL4 for bioinformatic analysis. Expressions of the genes in the flowers of different colors (i.e., white, pink, red, and deep red) at the budding (S1), initial flowering (S2), blooming (S3), and withering (S4) stages of I. uliginosa were determined using qRT-PCR. Result Iu4CL1, Iu4CL2, Iu4CL3, and Iu4CL4 had the cDNA lengths of 1620 bp, 1653 bp, 1698 bp, and 1638 bp encoding 539, 550, 565, and 545 amino acids, respectively. Iu4CL1 contained 2 introns and Iu4CL2, 4, but Iu4CL3 and Iu4CL4 had none. All 4 genes were signal peptide-free hydrophobic proteins, but only Iu4CL3 was unsterilized. Iu4CL2 had 3 transmembrane structures, but the other 3 had none. All of them belonged to the AMP-binding enzyme superfamily and the adenylate-forming domain class I superfamily with the highest homology with I. uliginosa. Iu4CL1 and Iu4CL2 were in one large branch, while Iu4CL3 and Iu4CL4 in another, suggesting a paraphyletic homology. The expressions of Iu4CL1 and Iu4CL3 peaked in S3 on the white flowers, Iu4CL2 on red flowers, and Iu4CL4 on dark red I. uliginosa. Conclusion It was evident that Iu4CLs played a crucial role in the anthocyanin biosynthesis of I. uliginosa.
- Impatiens uliginosa /
- 4CLs /
- flower color /
- gene cloning /
- expression analysis

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图 1 4种不同花色滇水金凤及4个不同花发育时期

Figure 1. Four colors and 4 development stages of I. uliginosa flowers

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图 2 滇水金凤Iu4CL基因克隆

Figure 2. Cloning of Iu4CL genes from I. uliginosa

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图 3 滇水金凤Iu4CL基因序列分析

Figure 3. Sequences of Iu4CLs from I. uliginosa

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图 4 滇水金凤Iu4CL基因蛋白三级结构的预测

Figure 4. Predicted tertiary structures of Iu4CLs fromI. uliginosa

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图 5 滇水金凤Iu4CL的同源氨基酸序列比对

Figure 5. Homologous amino acid sequence alignment of Iu4CLs from I. uliginosa

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图 6 基于滇水金凤Iu4CL氨基酸序列构建的系统进化树

Figure 6. Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Iu4CLs from I. uliginosa

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图 7 滇水金凤Iu4CL基因相对表达量

A：Iu4CL基因在4中不同花色盛花期的相对表达分析；B：Iu4CL基因在红色花器官的4个不同花发育时期的相对表达分析；不同字母差异显著（P<0.05）。

Figure 7. Relative expressions of Iu4CLs from I. uliginosa

A: Relative expressions of Iu4CLs in S3 for I. uliginosa of different flower colors; B: Relative expressions of Iu4CLs at 4 flower development stages of red I. uliginosa; a and b: data with different letters indicate significant difference at (P <0.05).

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表 1 4种不同花色滇水金凤采集地信息

Table 1. Information on collection locations of I. uliginosa of different flower colors

颜色 Color	采集地 Locality	经纬度 Latitude and longitude	海拔 Altitude/m
白色 White	昆明市阿子营 Aziying, Kunming	102°45′36″ E， 25°19′12″ N	2113
粉色 Pink	昆明市阿子营 Aziying, Kunming	102°45′36″ E， 25°19′12″ N	2113
红色 Red	昆明市捞鱼河湿地公园 Laoyuhe Wetland Park, Kunming	102°46′12″ E， 24°49′99″ N	1910
深红色 Deep Red	昆明市石林大叠水风景区 Dadieshui Scenic Spot, Kunming	103°12′ E，24°39′36″ N	1890

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表 2 Iu4CL基因引物序列

Table 2. Primer sequences of Iu4CLs

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence（5′-3′）	用途 Purpose
4CL1-F	ATGGAGAAATCTGGCTATGGAAG	全长克隆 Full Length Clones
4CL1-R	AGTGGGCTTTACAGCTTGGAC
4CL2-F	CTTGTCAGCTATGGCGCATAAC
4CL2-R	CCTAAAGCTTCGAGATAGCAAGC
4CL3-F	ATGTTGTCGATTCAAACAAACCAG
4CL3-R	TTAGGAAGCAAGTAATTTGGCTCG
4CL4-F	ATGGAGGCGGCTAATGCTAAG
4CL4-R	GTTAAAAATGACCAGCAACTAATC
4CL1-F	CGTGTTATGCAGGGGTACGG	qRT-PCR
4CL1-R	TGGAGACAGAGCCTTGGAAC
4CL2-F	TGTTGGGTCCGATTCCGATG
4CL2-R	AACGGAGAGACAGACGATGG
4CL3-F	ATGCTGAGGGATGGCTACAC
4CL3-R	GTGGCACCTGAAACCCTTTG
4CL4-F	ATCCAGTCGTTCCCGACGAATAC
4CL4-R	CGGCATCTCAATTTCATCCACC
Actin-F	TGAATGTCCCTGCTGTTTG
Actin-R	ACCTTCCGCATAACTTTACC

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表 3 滇水金凤Iu4CL蛋白生物信息学分析

Table 3. Bioinformatics of Iu4CLs from I. uliginosa

蛋白名称 Protein name	蛋白分子量 Protein molecular weight/kDa	总原子数 Total atomic number	分子式 Molecular formula	理论等电点 Theoretical isoelectric point	疏水系数 Hydrophobic coefficient	不稳定指数 Instability index	信号肽 Signal peptides	跨膜结构域 Transmembrane domains
4CL1	59.32	8428	C₂₆₇₅H₄₂₅₄N₇₀₀O₇₈₀S₁₉	8.15	95.06	35.01	否	否
4CL2	60.13	8540	C₂₇₀₃H₄₃₀₈N₇₁₂O₈₀₀S₁₇	8.40	94.31	36.40	否	是
4CL3	61.60	8775	C₂₇₈₇H₄₄₃₉N₇₁₁O₈₂₁S₁₇	5.67	102.81	43.51	否	否
4CL4	59.84	8466	C₂₆₇₈H₄₂₆₈N₆₉₈O₇₉₅S₂₇	5.45	97.14	38.56	否	否

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参考文献(29)

[1]	戴思兰, 洪艳. 基于花青素苷合成和呈色机理的观赏植物花色改良分子育种 [J]. 中国农业科学, 2016, 49(3):529−542. DAI S L, HONG Y. Molecular breeding for flower colors modification on ornamental plants based on the mechanism of anthocyanins biosynthesis and coloration [J]. Scientia Agricultura Sinica, 2016, 49(3): 529−542.(in Chinese)
[2]	MENG J X, WEI J, CHI R F, et al. MrMYB44-like negatively regulates anthocyanin biosynthesis and causes spring leaf color of Malus ‘radiant’ to fade from red to green [J]. Frontiers in Plant Science, 2022, 13: 822340. doi: 10.3389/fpls.2022.822340
[3]	郑雅琳. 花烟草花色多样性的遗传研究与表达分析[D]. 泰安: 山东农业大学, 2022 ZHENG Y L. Genetic research and expression analysis of flower color diversity in Nicotiana alata[D]. Taian: Shandong Agricultural University, 2022. (in Chinese)
[4]	TU M X, FANG J H, ZHAO R K, et al. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of VvbZIP36 promotes anthocyanin accumulation in grapevine (Vitis vinifera)[J]. Horticulture Research. DOI: 10.1093/hr/uhac022.
[5]	HAO Z D, LIU S Q, HU L F, et al. Transcriptome analysis and metabolic profiling reveal the key role of carotenoids in the petal coloration of Liriodendron tulipifera[J]. Horticulture Research, 2020, 7: 70.
[6]	李小兰. 丁家坝桃对低温胁迫的响应及Pp4CL2基因功能验证[D]. 兰州: 甘肃农业大学, 2022. LI X L. Response of Dingjiaba to low-temperature stress and Pp4CL2 function verification[D]. Lanzhou: Gansu Agricultural University, 2022. (in Chinese)
[7]	MANSELL R L, BABBEL G R, ZENK M H. Multiple forms and specificity of coniferyl alcohol dehydrogenase from cambial regions of higher plants [J]. Phytochemistry, 1976, 15(12): 1849−1853. doi: 10.1016/S0031-9422(00)88829-9
[8]	孙晓莎, 王遂, 赵曦阳, 等. 84K杨4CL3/4CL5基因克隆及生物信息学分析 [J]. 植物研究, 2019, 39(4):547−556. SUN X S, WANG S, ZHAO X Y, et al. Cloning and Bioinformatics Analysis 4CL3/4CL5 Gene of Populus alba × P. glandulosa [J]. Bulletin of Botanical Research, 2019, 39(4): 547−556.(in Chinese)
[9]	孙士超. 绿色棉纤维转录组分析及4CL基因家族的鉴定[D]. 石河子: 石河子大学, 2020 SUN S C. Transcriptome analysis of green cotton fiber and identification of 4CL gene family[D]. Shihezi: Shihezi University, 2020. (in Chinese)
[10]	阎莹莹. 藏药喜马拉雅紫茉莉中Mh4CL基因的序列分析及功能验证[D]. 拉萨: 西藏大学, 2021. YAN Y Y. Seuoence Analsis Functional Verification of Mh4CL Gene in Tibetan Medicine Mirabilis Himalaica[D]. Lhasa: Tibet University, 2021. (in Chinese)
[11]	WANG Y Y, GUO L H, ZHAO Y J, et al. Systematic analysis and expression profiles of the 4-coumarate: CoA ligase (4CL) gene family in pomegranate (Punica granatum L. ) [J]. International Journal of Molecular Sciences, 2022, 23(7): 3509. doi: 10.3390/ijms23073509
[12]	黄胜雄, 胡尚连, 孙霞, 等. 木质素生物合成酶4CL基因的遗传进化分析 [J]. 西北农林科技大学学报(自然科学版), 2008, 36(10):199−206. HUANG S X, HU S L, SUN X, et al. Genetic and evolutionary analysis of lignin biosynthase 4CL gene [J]. Journal of Northwest A & F University (Natural Science Edition), 2008, 36(10): 199−206.(in Chinese)
[13]	田晓明, 颜立红, 向光锋, 等. 植物4香豆酸: 辅酶A连接酶研究进展 [J]. 生物技术通报, 2017, 33(4):19−26. TIAN X M, YAN L H, XIANG G F, et al. Research progress on 4-coumarate: Coenzyme A ligase(4CL) in plants [J]. Biotechnology Bulletin, 2017, 33(4): 19−26.(in Chinese)
[14]	STUIBLE H, BÜTTNER D, EHLTING J, et al. Mutational analysis of 4-coumarate: CoA ligase identifies functionally important amino acids and verifies its close relationship to other adenylate-forming enzymes [J]. FEBS Letters, 2000, 467(1): 117−122. doi: 10.1016/S0014-5793(00)01133-9
[15]	侯冲, 晁楠, 戴明洁, 等. 桑树4CL基因家族的筛选和Mm4CL2的功能研究 [J]. 蚕业科学, 2022, 48(1):18−24. HOU C, CHAO N, DAI M J, et al. Screening of 4CL family genes in mulberry and functional study of Mm4CL2 [J]. Acta Sericologica Sinica, 2022, 48(1): 18−24.(in Chinese)
[16]	乔中全, 王晓明, 曾慧杰, 等. 灰毡毛忍冬Lm4CL基因克隆及表达分析 [J]. 中南林业科技大学学报, 2021, 41(5):122−132. QIAO Z Q, WANG X M, ZENG H J, et al. Clone and expression analysis of Lm4CL in Lonicera macranthoides Hand-Mazz [J]. Journal of Central South University of Forestry & Technology, 2021, 41(5): 122−132.(in Chinese)
[17]	赵莹, 杨欣宇, 赵晓丹, 等. 植物类黄酮化合物生物合成调控研究进展 [J]. 食品工业科技, 2021, 42(21):454−463. ZHAO Y, YANG X Y, ZHAO X D, et al. Research progress on regulation of plant flavonoids biosynthesis [J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(21): 454−463.(in Chinese)
[18]	刘航程, 孙爽, 徐秀琴, 等. ‘月月粉’和野蔷薇花青素合成酶基因的鉴定与表达分析 [J]. 分子植物育种, 2021, 19(6):1811−1821. LIU H C, SUN S, XU X Q, et al. Identification and expression analysis of anthocyanin biosynthesis genes in Rosa chinensis and Rosa multiflora [J]. Molecular Plant Breeding, 2021, 19(6): 1811−1821.(in Chinese)
[19]	HUANG C Y, WEN W E, LI Q Q, et al. Identification, characterization and expression analysis of the 4-coumarate-coA ligase gene family in Bletilla striata [J]. Gene Reports, 2023, 32: 101785. doi: 10.1016/j.genrep.2023.101785
[20]	徐靖, 林延慧, 王效宁, 等. 甘薯4-香豆酸辅酶A连接酶基因的生物信息学鉴定和表达分析 [J]. 西北植物学报, 2020, 40(4):581−587. XU J, LIN Y H, WANG X N, et al. Bioinformatic identification and expression analysis of 4CL genes in Ipomoea batatas [J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2020, 40(4): 581−587.(in Chinese)
[21]	宫树森, 杨霏, 王青芬, 等. 4CL基因在海巴戟叶片莨菪亭累积过程中的功能研究 [J]. 热带作物学报, 2022, 43(10):1989−1997. GONG S S, YANG F, WANG Q F, et al. Function of gene 4CL during the accumulation of scopoletin in Morinda citrifolia leaves [J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2022, 43(10): 1989−1997.(in Chinese)
[22]	李逸, 徐欢欢, 张宇辰, 等. 大葱4-香豆酸辅酶A连接酶基因Af4CL的克隆及表达分析 [J]. 农业生物技术学报, 2023, 30(2):273−281. LI Y, XU H H, ZHANG Y C, et al. Cloning and expression analysis of 4-coumaric acid coenzyme A ligase gene Af4CL in Allium fistulosum [J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2023, 30(2): 273−281.(in Chinese)
[23]	郭凯. 水稻细胞壁基因表达调控网络以及4CL基因演化模式解析[D]. 武汉: 华中农业大学, 2015 GUO K. Globle profiling of gene expression patterns involved in rice cell wall network formatons and analysis of 4CL gene evolution[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2015. (in Chinese)
[24]	郭辉力. 4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)-芪合酶(STS)基因融合、表达、催化活性鉴定及其在枣树中的过表达[D]. 北京: 北京林业大学, 2016 GUO H L. Construction, expression and catalytic activity identification of 4CL-STS fusion gene and its overexpression in Ziziphus jujube mill[D]. Beijing: Beijing Forestry University, 2016. (in Chinese)
[25]	马馨馨, 许洋, 赵欢欢, 等. 番茄4CL基因家族鉴定和氮素处理下的表达分析 [J]. 生物技术通报, 2022, 38(4):163−173. MA X X, XU Y, ZHAO H H, et al. Identification of tomato 4CL gene family and expression analysis under nitrogen treatment [J]. Biotechnology Bulletin, 2022, 38(4): 163−173.(in Chinese)
[26]	罗庆, 钟秀来, 卢松, 等. 胡萝卜1个新4CL基因的克隆、进化及表达分析 [J]. 江苏农业科学, 2020, 48(15):89−94. LUO Q, ZHONG X L, LU S, et al. Cloning, evolution and expression of a new 4-coumarate: CoA ligase gene in carrot (Daucus carota L.) [J]. Jiangsu Agricultural Sciences, 2020, 48(15): 89−94.(in Chinese)
[27]	陈锐, 马道铖, 徐睆, 等. 野蔷薇4CL基因的克隆及表达分析 [J]. 北方园艺, 2022(17):69−78. CHEN R, MA D C, XU H, et al. Cloning, sequencing and expression analysis of Rosa multiflora Rm4CL gene [J]. Northern Horticulture, 2022(17): 69−78.(in Chinese)
[28]	黄小玲, 张登, 廖嘉明, 等. 荧光定量PCR技术的原理及其在植物研究中的应用 [J]. 安徽农业科学, 2018, 46(25):36−40. HUANG X L, ZHANG D, LIAO J M, et al. Principles and applications of fluorescent quantitative PCR in plant research [J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2018, 46(25): 36−40.(in Chinese)
[29]	何磊, 严希, 袁圆, 等. 辣椒4CL基因家族成员的鉴定与生物信息学分析 [J]. 分子植物育种, 2022, 20(8):2478−2484. HE L, YAN X, YUAN Y, et al. Identification and bioinformatics analysis of the 4CL gene family members in pepper(Capsicum annuum) [J]. Molecular Plant Breeding, 2022, 20(8): 2478−2484.(in Chinese)