禽流感是由禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)引起的禽类全身性或呼吸性的疾病综合症^[1]，根据其致病性可分为高致病性和低致病性2类^[2]。H5N1亚型禽流感病毒引起鸭群的暴发性死亡，而H9N2亚型禽流感病毒为低致病性禽流感病毒，并不导致感染家禽大批死亡，只引起家禽轻微的呼吸道症状，产蛋鸡产蛋量下降等^[3]。但H9N2亚型禽流感病毒传播广泛，病毒有可能通过水禽的粪便排出而污染水源及其饲养场所，使水禽成为重要的传播媒介，导致病原的流行性发生^{[4, 5]}。鸭坦布苏病毒病(Duck Tembusu Virus Disease，DTVD)是由鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)引起的一种急性传染病^[6]。该病以高热、产蛋量骤降甚至停产和卵泡出血为主要特征，病程可长达数周^{[7, 8, 9, 10, 11]}。随着我国养鸭业的迅速发展，鸭禽流感及鸭坦布苏病已成为危害养鸭业发展的重要传染病，而且是常发病，及时准确地诊断对控制这些传染病具有非常重要的意义。目前禽流感的诊断方法主要有血凝试验、血凝抑制试验(HA、HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光试验、琼脂扩散试验(AGP)、病毒中和试验等，但这些方法在灵敏度、特异性、时效性、易用性、稳定性等方面存在一定的缺陷^[12]。坦布苏病毒的诊断目前主要靠病毒的分离，也有一些分子生物学的方法，但还不够成熟，常会造成误诊，给养殖户造成较大损失。临床上由于坦布苏病毒感染与禽流感病毒感染常常难以区分，或者混合感染，而且禽流感病毒还有亚型的区分，因此需要对2种甚至2种以上的病毒同时进行检测，但目前的方法一次试验只能检测1种病毒，如需检测多种病毒要做多次检测，不仅费时费力，还可能造成误诊。因此，本试验旨在通过一次检测，可同时区分鸭坦布苏病毒、禽流感病毒的单一或混合感染，为及时控制疫病提供有效检测方法。

H5亚型AIV、H9 亚型AIV、鸭坦布苏毒株(DTMUV)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所禽病研究室提供；鸭肝炎病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、鸭副黏病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒等由华南农业大学禽病重点实验室提供。

RNA提取试剂购自TIANGEN公司；HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒购于康为试剂公司；DNA聚合酶和RNA酶抑制剂购自北京全式金生物技术有限公司；DL2000 DNA Marker购自英特生物有限公司。

美国BIO-RAD公司生产的C1000PCR仪、德国HERMLE公司生产的低温高速离心机、北京六一仪器厂生产的DYY-6C型电泳仪、美国BIO-RAD公司生产的凝胶成像系统、海尔-80℃超低温冰箱等、Quawell 公司生产的UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度计等。

根据GenBank已发表的DTMUV NS5 基因、H5亚型与H9亚型 AIV HA 基因的保守核苷酸序列，用 DNA STAR和OLIGO 6.0 软件分别设计针对3种鸭病原的扩增引物，经BLAST进行特异性比对验证，分别获得3对特异性引物(表 1)。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，置-20℃保存备用。

表 1(Tab.1)

表 1 引物序列信息 Tab.1 Sequences of primers 引物 序列(5′-3′) 位置 参考毒株序列号 H5F AGTGAATTGGAATATGGTAACTG 875~897 KM186136 H5R AACTGAGTGTTCATTTTGTCAAT 1254~1232 H9F TGCATHGGYYAYCARTCAACAAA 95~117 AF156376 H9R CATACCAWGGRGCDATTARATTYCCAT 800~826 DTVF GGAAAAGATGGAACCAATGCACAG 188~213 JQ928189 DTVR GCGCTCTGTTTCCTCGGGGAGCAG 414~437

表 1 引物序列信息 Tab.1 Sequences of primers

利用TIANamp Virus RNA Kit(离心柱型病毒RNA提取试剂盒)提取病毒RNA，用HiFiScript cDNA第一链合成试剂盒进行反转录：采用20 μL体系，于EP 管中依次加入 Primer Mix 2 μL、2.5 mmol·L^-1 dNTP 4 μL、RNA模板4 μL、无RNA 酶的灭菌水2 μL，总体积共12 μL，70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min。短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。继续向以上反应液中加入5×RT Buffer 4 μL、0.1 mmol·L^-1 DDT 2 μL，RNA酶抑制剂1 μL，轻轻吹打混匀，42℃孵育2 min。加入1 μL HiFiScript(200 μ·μL^-1)，轻轻吹打混匀，42℃孵育50 min，85℃孵育5 min。反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却或将制备的 cDNA置-20℃ 保存备用。

多重PCR发应在25 μL反应体系中进行：10×buffer (2.5 μmoL·L^-1) 2 μL，MgCl₂(25 mmoL·L^-1) 2 μL，dNTPs 2 μL，DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV上下游引物各0.5 μL，DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV基因组DNA各2 μL，Taq酶(5 U·μL^-1) 0.5 μL，加dd H₂O 至总体积为25 μL。对DTMUV 引物、H5亚型AIV 引物、H9亚型AIV引物用量进行优化，对终浓度组合(组合中H5亚型AIV、H9亚型AIV和DTMUV的引物对终浓度组合设置如下(0.5、0.5、0.5；0.5、1.0、0.5；0.5、1.0、1.0；1.0、0.5、0.5；1.0、1.0、1.0 μmol·L^-1)反应条件进行优化，多次重复后确定引物最佳反应用量。将退火温度按50～60℃依次递增，多次重复后确定最佳退火温度，筛选出多重PCR最佳反应条件。将扩增获得的3种病原的目的片段经切胶回收纯化后，送上海生工生物技术公司进行测序，获得的测序结果经BLAST比对分析，确定所扩增序列的正确性。

采用优化后的扩增条件，以DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV、鸭新城疫病毒、鸭肝炎病毒、番鸭呼肠孤病毒的cDNA和番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭瘟病毒的DNA作为待测样品进行检测，并以无菌水作为阴性对照，检测三重PCR特异性。

将提取的DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV 3种病毒RNA，用UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度计测定其浓度，并按10倍递增稀释，各取1 μL，按照上述优化的PCR反应条件进行PCR检测，以其模板最高稀释倍数扩增呈阳性为其PCR的敏感度。

2014-2015年，于江西南昌、丰城、南丰、地区鸭群收集200份临床病料,采集肝脏、胰、脾等组织，与生理盐水按照1∶3的比例进行研磨后离心，使用TIANamp Virus RNA Kit(离心柱型病毒RNA提取试剂盒)提取病毒RNA，按优化后的多重PCR程序进行反应，计算阳性率。

多重PCR反应条件为总体积20 μL：10×buffer (2.5 μmoL·L^-1) 2 μL，MgCl₂ (25 mmoL·L^-1) 2 μL，dNTPs 2 μL，DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV上下游引物各0.5 μL，DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV基因组DNA各2 μL，Taq酶(5 U·μL^-1) 0.5 μL，加灭菌水至总体积为20 μL。经GenBank数据库的BLAST比对分析表明，所获得的3个扩增片段均为相应病毒的基因序列，且与预期的扩增条带大小一致。

对含有DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的核酸样品进行检测，均能扩增出与预期相符的250、380、732 bp条带，而其他鸭病病原体在相同位置并未出现特异性条带，说明该方法具有良好的特异性(图 1)。

图 1 三重PCR特异性试验 Fig. 1 Specificity test of the triplex PCR 注：M为100 bp DNA ladder; 1为鸭坦布苏病毒+H9 亚型AIV+ H5 亚型AIV; 2为H9亚型AIV; 3为H5亚型 AIV;4为鸭坦布苏病毒; 5为番鸭呼肠孤病毒; 6为番鸭细小病毒;7为鸭圆环病毒; 8为鸭新城疫病毒; 9为鸭肝炎病毒;10为鸭瘟病毒; 11为阴性对照。

用UV-Vis Spectrophotometer Q5000微量分光光度计测得DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的RNA分别为660 ng·μL^-1、533 ng·μL^-1、560 ng·μL^-1，应用优化后的多重PCR方法对10倍梯度稀释的混合RNA进行检测，结果表明，该多重PCR对DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的检测极限分别为6.6 ng·μL^-1、533 pg·μL^-1、56 pg·μL^-1(图 2)。

图 2 三重PCR敏感性试验 Fig. 2 Sensitivity test of the triplex PCR 注：M为100 bp DNA ladder；1为 660 ng·μL-1DTMUV，533 ng·μL-1 H5，560 ng·μL-1 H9；2为66 ng·μL-1LDTMUV，53.3 ng·μL-1L H5，56 ng·μL-1 H9；3为6.6 ng·μL-1DTMUV，5.33 ng·μL-1 H5，5.6 ng·μL-1 H9；4为660 pg·μL-1LDTMUV，533 pg·μL-1 H5，560 pg·μL-1 H9；5为66 pg·μL-1DTMUV，53.3 pg·μL-1 H5，56 pg·μL-1 H9；6为6.6 pg·μL-1DTMUV，5.33 pg·μL-1 H5，5.6 pg·μL-1 H9。

利用建立的多重PCR方法，对2014-2015年江西南昌、丰城、南丰、地区鸭群收集的200份临床病料进行检测，结果(图 3)检测出DTMUV 7份(阳性率为3.5%)，H5亚型AIV 9份(阳性率为4.5%)，H9亚型AIV 4份(阳性率为2%)。

图 3 三重RT-PCR临床样品部分检测结果 Fig. 3 Detection results of clinical samples using the triplex PCR 注：M为100 bp DNA ladder;1,3,6,7,8为H5亚型AIV阳性病料; 2为H9亚型AIV阳性病料; 4,5为H5亚型AIV与 H9亚型AIV阳性混合病料。

DTMUV和AIV的2种亚型均是当今危害养鸭业发展的主要病原体，常呈混合感染。这3种病毒对养鸭业危害较大。禽流感病毒和坦布苏病毒均能感染蛋鸡、鸭和鹅，并导致产蛋下降，在开产(蛋)鸡、开产种(蛋)鸭、肉用鸭发生坦布苏病毒时，都应注意与禽流感病毒的鉴别诊断。因此，快速并且同时检测这3种病原具有重要的临床意义。

虽然鸭坦布苏病毒及禽流感病毒都已经有RT-PCR的检测方法，但是同时检测3种病毒的诊断方法还未报道。本研究建立的多重PCR方法能够用于DTMUV、H5亚型AIV、H9亚型AIV的单纯感染和混合感染检测。多重PCR反应条件的优化是多重PCR成功的关键，比常规PCR复杂得多^[13]，考虑到多重PCR反应引物之间容易产生干扰，本研究设计的引物的目的片段的大小有合适的梯度(DTMUV为250 bp,H5亚型AIV为380 bp,H9亚型AIV为732 bp)，引物退火条件尽可能相近(DTMUV为53℃,H5亚型AIV为53.6℃,H9亚型AIV为54.1℃)，引物用量均为0.5 μL(0.5 μmol·L^-1)。多重PCR的优点主要体现在能同时检测的基因数目增多及反应的敏感性、特异性等方面^[14]。通过特异性和敏感性试验，发现本试验构建的多重RT-PCR能够特异性扩增出H5亚型AIV、H9亚型AIV 和DTMUV等3种病原，对鸭的其他病原不敏感，特异性良好；能同时检出6.6 ng·μL^-1的DTMUV、533 pg·μL^-1的H5亚型AIV、56 pg·μL^-1 的H9亚型AIV，具有较高的敏感性，能满足3种病原的临床检测要求，适用于大批量检测，为及时控制疫病提供有效方法。