石斛是兰科Orchidacede石斛属Dendrobium植物的总称，不仅具有药用价值和保健功能,还具有较高的观赏价值。石斛花颜色丰富，花形各异，花期长。随着人们对石斛的需求量逐年增大，野生石斛资源被大量采挖，加上石斛自然条件下发芽率极低的原因，导致野生石斛资源逐年减少。因此对石斛的结实性进行研究，选育出综合性状优良的石斛新品种，对于满足市场需求，丰富石斛种质资源具有十分重要的意义。

在国内石斛属植物作为药用石斛近40种^[1]，目前已有石斛的有性杂交育种的相关报道，龚建英等^[2]对4种石斛的杂交、自交的亲和性进行研究，结果表明不同种的石斛杂交、自交亲和性存在明显差异。付传明等^[3]用铁皮石斛和钩状石斛为亲本，通过人工辅助授粉获得杂交种子，并进行了无菌播种技术研究。潘春香等^[4]以4种药用石斛为材料，在蕾期和花期分别进行人工辅助自交和杂交试验，结果表明人工辅助授粉是提高石斛结果率的有效方法之一。国外也有石斛杂交的相关报道，丹麦的Johansen^[5]也曾在不同原种间进行杂交，254次杂交授粉中收获46个杂交果实，并且大部分组合反交不结实，只有6组可以通过双向杂交产生果实，并且它们的亲本都来源于同一组 。同科的观赏植物兰花的育种工作的研究已比较深入，且成效显著^[6]。

本课题组从2013年开始在全国收集了近40份石斛兰资源，并进行栽培和生物学特性观察研究。本研究充分利用从各地引进的石斛种质资源，对石斛进行人工辅助授粉的杂交和自交试验，总结各种石斛杂交和自交结实性规律，为石斛杂交育种亲本选择以及杂交组合的选配提供参考，提高育种效率。

供试材料为引种于福建、云南的石斛以及石斛杂交后代。分别是铁皮石斛D.officinale、金钗石斛D.nobile、鼓槌石斛D.chrysotoxum、黑毛石斛D.williamsonii、报春石斛D.primulinum、大苞鞘石斛D.wardianum、杯鞘石斛D.gratiosissimum、肿节石斛D.pendulum、滇桂石斛D.guangxiense、兜唇石斛D.phyllum、棒节石斛D.findlayanum、细茎石斛D.moniliforme、重唇石斛D.hercoglossum、密花石斛D.densiflorum、杂交石斛后代D.officinale ♀×D.nobile♂,共计15种石斛。供试材料已在三明市农业科学院温室内栽培2~4年。植株生长表现良好。温室温度维持在7～34℃，空气相对湿度在50%～85％。

用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法测定石斛花粉生活力。TTC染色法是根据石斛花粉粒的呼吸酶活性来测定花粉生活力。将不同石斛的花粉分别加入体积分数为0.5％TTC溶液染色^[7]，染色后在37℃下暗培养14 h ,在100倍显微镜下观察染色情况，统计花粉染色率，花粉生活力(％)=(有活力的花粉/观察花粉数)×100％。试验重复3次。

在开花期分别用铁皮石斛、黑毛石斛、报春石斛、金钗石斛、大苞鞘石斛、杯鞘石斛、棒节石斛、细茎石斛、重唇石斛、密花石斛、棒节石斛、 杂交石斛等12个为亲本，进行同株异花人工授粉和异株异花授粉，用未进行人工授粉的石斛为对照。石斛花朵开放后2 d，于上午时间进行人工授粉。 授粉时用镊子除去药帽，取下花粉，将花粉块移至母本的柱头上，去除花粉和唇瓣，挂牌标明亲本名称和授粉时间。于授粉后观察花部情况，如子房膨大正常发育，在90 d内不落果，变黄的情况则认为正常结实。统计结实数情况。坐果率＝蒴果数/授粉花朵总数×100％^[8]。

用铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、报春石斛等4个为亲本，采用双列杂交交配设计(表 1)，共设计种间授粉杂交12个组合。授粉方法同上，最后统计授粉朵数和结实数。

表 1(Tab.1)

表 1 石斛杂交组合 Tab.1 Cross combinations of Dendrobium 铁皮石斛(A) 金钗石斛(B) 鼓槌石斛(C) 报春石斛(D) 铁皮石斛(A) - AB AC AD 金钗石斛(B) BA - BC BD 鼓槌石斛(C) CA CB - CD 报春石斛(D) DA DB DC -

表 1 石斛杂交组合 Tab.1 Cross combinations of Dendrobium

15种石斛花粉生活力用TTC染色法测定结果如图 1所示。研究结果表明：不同的石斛种间所需染色时间不同，部分品种在染色培养30 min后开始变红，在染色14 h后观察效果较好(图 2-A)。石斛种间的花粉生活力差异较大，介于38.0％～79.3％之间，花粉生活力最高是大苞鞘石斛，为79.3％；最低的是黑毛石斛，为38.0％。平均花粉生活力高低依次为大苞鞘石斛、鼓槌石斛、杯鞘石斛、铁皮石斛、金钗石斛、报春石斛、兜唇石斛、棒节石斛、重唇石斛、细茎石斛、杂交石斛、密花石斛、滇桂石斛、肿节石斛、黑毛石斛。

图 1 石斛花粉TTC染色法染色率 Fig. 1 Pollen vitality of Dendrobium by TTC

图 2 石斛花粉生活力、人工授粉结荚与后代苗生长情况 注：A为杯鞘石斛花粉TTC染色(×100)；B为金钗石斛自交果荚；C为铁皮石斛×重唇石斛杂交果荚；D为大苞鞘自交后代苗；E为密花石斛×铁皮石斛杂交后代苗。 Fig. 2 Pollen vitality,fruit-bearing and seedling development of Dendrobium

供试的石斛在自然条件下(对照)结实率均为0。结果表明石斛在无外力辅助授粉时几乎不能结实这一现象^[9]。石斛通过异株异花人工授粉的结实率普遍比同株异花人工授粉高。由表 2可知，铁皮石斛人工授粉的平均自交结实率最高，为73.3％；其次是金钗石斛，为63.3％(图 2-B)；杯鞘石斛较低，为13.3％；鼓槌石斛、细茎石斛、重唇石斛、杂交石斛人工授粉后均无结实。石斛人工自交授粉平均结实率高低顺序为铁皮石斛>金钗石斛>大苞鞘石斛>棒节石斛>黑毛石斛>密花石斛>杯鞘石斛。

表 2(Tab.2)

表 2 石斛属植物不同授粉方式结实率 Tab.2 Fruit-bearing rates of Dendrobium by artificial pollinations 品种名称 授粉方式 授粉数/朵 结实数/个 结实率/％ 人工授粉平均结实率/％ 品种名称 授粉方式 授粉数/朵 结实数/个 结实率/％ 人工授粉平均结实率/％ 铁皮石斛 同株异花授粉 15 12 80.0 73.3 杯鞘石斛 同株异花授粉 15 2 13.3 13.3 异株异花授粉 15 10 66.6 异株异花授粉 15 2 13.3 金钗石斛 同株异花授粉 15 11 73.3 63.3 棒节石斛 同株异花授粉 15 7 46.7 50.0 异株异花授粉 12 8 53.3 异株异花授粉 15 8 53.3 鼓槌石斛 同株异花授粉 15 0 0 0 细茎石斛 同株异花授粉 15 0 0 0 异株异花授粉 15 0 0 异株异花授粉 15 0 0 黑毛石斛 同株异花授粉 15 4 26.7 33.4 重唇石斛 同株异花授粉 15 0 0 0 异株异花授粉 15 6 40.0 异株异花授粉 15 0 0 报春石斛 同株异花授粉 15 3 20.0 26.7 密花石斛 同株异花授粉 15 4 26.7 23.4 异株异花授粉 15 5 33.3 异株异花授粉 15 3 20.0 大苞鞘石斛 同株异花授粉 15 8 53.3 60.0 杂交石斛 同株异花授粉 15 0 0 0 异株异花授粉 15 10 66.6 异株异花授粉 15 0 0

表 2 石斛属植物不同授粉方式结实率 Tab.2 Fruit-bearing rates of Dendrobium by artificial pollinations

由表 3可知，石斛属间杂交结实率较低，其中铁皮石斛(♀)与鼓槌石斛(♂)杂交结实率最高，为86.7％，铁皮石斛(♀)与金钗石斛(♂)杂交结实率为33.3％；报春石斛(♀)与鼓槌石斛(♂)杂交结实率为13.3％。结果表明石斛种间人工辅助杂交授粉可结实。以铁皮石斛为母本共获得18个杂交种果荚(图 2-C)，以报春石斛为母本获得2个杂交果荚。其余的杂交组合结果荚为0。表明铁皮石斛作为杂交母本较容易结实，可培育出杂交后代。鼓槌石斛作为父本，共获得了15个杂交种果实，表明鼓槌石斛是较好的父本材料。

表 3(Tab.3)

表 3 石斛属植物杂交结实率 Tab.3 Fruit-bearing rate of crossed Dendrobium 杂交组合 母本 父本 杂交组合/个 结荚/个 坐果率/％ AB 铁皮石斛 金钗石斛 15 5 33.3 AC 铁皮石斛 鼓槌石斛 15 13 86.7 AD 铁皮石斛 报春石斛 15 0 0 BA 金钗石斛 铁皮石斛 15 0 0 BC 金钗石斛 鼓槌石斛 15 0 0 BD 金钗石斛 报春石斛 15 0 0 CA 鼓槌石斛 铁皮石斛 15 0 0 CB 鼓槌石斛 金钗石斛 15 0 0 CD 鼓槌石斛 报春石斛 15 0 0 DA 报春石斛 铁皮石斛 15 0 0 DB 报春石斛 金钗石斛 15 0 0 DC 报春石斛 鼓槌石斛 15 2 13.3

表 3 石斛属植物杂交结实率 Tab.3 Fruit-bearing rate of crossed Dendrobium

在正反交组合中，铁皮石斛与金钗石斛正交杂交时结5个果荚，而反交则无结果。铁皮石斛与鼓槌石斛正交杂交结了13个果荚，而反交无结果实。报春石斛与鼓槌石斛正交杂交结2个果荚，而反交也无结果。表明在进行杂交育种时，选择适宜材料作为父本或母本，是提高结实率的前提，父母本亲和性直接影响杂交结实率。铁皮石斛与报春石斛，金钗石斛与鼓槌石斛，金钗石斛与报春石斛无论是正交还是反交均不结果荚，表现为不亲和。

TTC染色法是根据花粉粒的呼吸酶活性来判断花粉活力的一种快速简便的检测方法，用该方法检测牡丹、芍药等新鲜花粉活力的准确性很高^{[10, 11]}。李枝林^[12]研究认为兰科植物的花粉块有外膜的包裹而不易散开，且花粉壁相对较厚，导致染色剂不易使兰科植物的花粉粒着色。但本研究通过延长染色时间方法可将花粉粒清楚的染色，在染色14 h后染色效果较好。在花粉培养时盖玻片不宜压太紧，否则影响花粉的呼吸作用，影响了观察效果。

本研究结果表明花粉的生活力与结实率无明显正相关。主要原因是石斛花粉数量多，无论是自交或杂交，受花粉生活力影响较小，受两者的亲和性影响较大。对照组(自然授粉)柱头没闭合，没有结果荚。石斛为虫媒花，花粉有蜡质，须通过昆虫来传播授粉^[13]。本试验在玻璃温室中进行，未发现有昆虫来采粉。同时石斛花粉被药帽盖住，成熟花粉的药帽不易脱落，这是对照组自然授粉没有结实的原因。人工授粉可以明显提高石斛结实率，这对石斛资源保护和育种具有重要的意义。

本试验结果表明石斛种间杂交亲和力差异较大，结果率在0～86.7％，部分石斛杂交或自交不结实的原因有待进一步研究。在进行人工授粉时，挑选适宜材料作为父母本，可提高结实率，父母本亲和性直接影响杂交结实率。通过育种材料杂交结实率结果分析发现，部分种和品种作为母本或父本结实性高，而反交结实性则低。铁皮石斛与鼓槌石斛杂交时，用铁皮石斛为父本时，其结实率为0；为母本其最佳结实率86.7％，其亲和性与父母本的选择有关。在单株中控制授粉数量可以减少母本植株营养的消耗，提高坐果率。其次天气也会对结实性产生影响，阴雨天气会影响结实，且果荚易感染病害，结果和耿秀英^[14]研究结果一致。为了提高坐果率，可在晴天进行授粉，并在柱头闭合后，把花瓣去除，避免感染病害。

利用石斛属种间杂交可亲和的规律，结合其杂交亲和性规律进行杂交配组，通过子代植株的综合评价，选育出优良品种。本课题组通过多年石斛的杂交育种实践，已总结了石斛杂交育种相关技术经验和杂交结实性规律，从而减少育种的盲目性，提高育种效率，缩短育种时间。目前部分石斛杂交种子已播种出苗(图 2-D~E)，后代的优良性状与遗传稳定性方面也有待进一步研究。