由青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum引起的植物细菌性青枯病是世界范围的毁灭性土传病害，在热带和亚热带地区发生普遍，危害严重^[1]，每年由青枯病引起的植物产量损失达10%～80%^{[2, 3, 4]}。目前，对该病害的防治措施包括农业防治(如嫁接、抗病育种、土壤改良、轮作套种等)、化学防治、生物防治(如芽孢杆菌、链霉菌等生防菌的利用)等均未能达到理想的防治效果^[5]。

许多研究表明，青枯雷尔氏菌无致病力菌株能在一定程度上控制青枯病的发展^{[6, 7, 8, 9]}。本课题组成员从番茄青枯病发病田块的健康植株中分离到1株生物学特性稳定的无致病力青枯雷尔氏菌avirulent Ralstonia salanacearum，菌株名称FJAT-1458，该菌株经回接番茄盆栽苗试验，证明其能侵染番茄植株但不会引起植株发病，利用该菌株作为青枯病疫苗，在植物苗期接种，能够预防青枯病的发生^[10]。

研究发现植物青枯病发生与植株根系分泌物及土壤成分关系密切^[11]。青枯雷尔氏菌在不同植物根系土壤分布数量不同^[12]。AbdeL-Ghafar研究发现大蒜能最大程度减少土壤中青枯菌的数量^[13]。Michel等研究不同前茬对番茄青枯病的影响，结果表明前茬茄子的土壤中青枯菌数量最多，而前茬水稻的土壤中未发现青枯菌^[14]。本研究对番茄、辣椒、韭菜、粉蕉等不同植物进行根系液浸提，分析不同植物根系浸提液对青枯病疫苗菌株FJAT-1458生长特性的影响，以期为青枯病疫苗在不同作物上的应用提供理论依据。

供试的青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458和致病性青枯雷尔氏菌Ralstonia solanacearum菌株FJAT-91分别分离自番茄青枯病田块健康植株和病株，由福建省农业科学院农业生物资源研究所菌种库收集并保存。

供试的植物根系样品为番茄、辣椒、韭菜和粉蕉。

采集时间：2010年12月。采集地点：番茄、辣椒、韭菜样品采自福建莆田，粉蕉样本采自福建漳州。采集方法：通过多点取样法截取植株根(或地下块茎)300 g，用蒸馏水清洗干净，晾干。

取植株根部样品100 g进行研磨，磨碎样品放入棕色瓶，加入蒸馏水，使样品和水质量比为1∶1，震荡过夜，离心取上清液，用0.22 μm细菌过滤器除菌，制备根系浸提液，4℃冰箱保存备用。

菌株FJAT-1458和FJAT-91活化于TTC培养基^[15]，挑取单菌落转接于SPA液体培养基中，置于30℃、170 r·min^-1摇床上振荡培养24 h，将菌液稀释，用TTC平板涂布计数，确定菌体的浓度。

分别量取番茄、辣椒、韭菜和粉蕉根系浸提液各45 mL，每种根系浸提液中加入5 mL的 FJAT-1458菌液或FJAT-91菌液，5 mL FJAT-1458菌液或FJAT-91菌液中加入45 mL无菌水处理作为对照，设3个重复，将上述各处理置于30℃、170 r·min^-1摇床上振荡培养，分别于第2、4、8、16、32 h取样，进行菌体浓度测定、OD₆₀₀值的测定。

菌体浓度测定：将样本进行系列梯度稀释，涂布于TTC平板，30℃，培养48 h，统计菌株FJAT-1458或FJAT-91的活菌数。每个处理重复3次。

OD₆₀₀值测定：测定方法参考车建美等的方法^[16]，取2 mL的样品，测定600 nm吸光度。

样本处理方法与1.5相同，分别于处理后第2、4、8、16、32 h取样，以弱化指数为指标，测定不同植物根系浸提液处理对青枯病疫苗菌株FJAT-1458和致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91致病性的影响，弱化指数的测定参照刘波等^[7]的方法进行，将样本进行系列梯度稀释，涂布于TTC平板，30℃，培养48 h，随机选取每处理组FJAT-1458和FJAT-91在TTC平板上的30个单菌落，在Leica M165FC电动荧光体视显微镜测量并计算弱化指数，取平均值。

样本处理方法与1.5相同，将不同植物根系浸提液和无菌水处理32 h的FJAT-1458样本 稀释100倍，伤根接种至5~6叶龄番茄盆栽苗，3 d后接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91(接种浓度10⁶ cfu·mL^-1)，单独接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91作为阳性对照，以无菌水为阴性对照，接种量为50 mL·盆^-1，每个处理20盆，设3个重复，每天观察植株发病情况，统计植株发病率。

试验结果用DPS数据处理系统进行数据处理，结合LSD(Least-Significant Difference)法对统计结果进行显著性方差分析。

测定番茄、辣椒、粉蕉和韭菜根系浸提液处理的FJAT-1458和FJAT-91在不同时间(2、4、8、16、32 h)的活菌量，结果如图 1所示，番茄、辣椒、粉蕉根系浸提液对菌株FJAT-1458生长均有一定的促进作用(图 1-A)，番茄和辣椒根系浸提液对菌株FJAT-91也有一定的促进作用，粉蕉根系浸提液处理与对照处理的菌株FJAT-91在不同处理时间内生长量相当(图 1-B)。番茄根系浸提液对菌株FJAT-1458和FJAT-91的促进作用最明显，处理32 h的FJAT-1458菌体含量为4.2 × 10⁹cfu·mL^-1，比原始含量(5.0×10⁷cfu·mL^-1)增长了84倍，比对照处理32 h的FJAT-1458菌体含量(1.5 × 10⁸cfu·mL^-1)增长了28倍；处理32 h的FJAT-91菌体浓度比原始含量增长了70.4倍，比对照处理增长了30倍。韭菜根系浸提液会抑制菌株FJAT-1458和FJAT-91的生长，处理8 h及以后，FJAT-1458和FJAT-91的菌体浓度均为0。

图 1 不同植物浸提液处理对菌体含量影响 注：A为FJAT-1458，B为FJAT-91，图 2同。 Fig. 1 Effect of root extracts on bacterial counts

测定番茄、辣椒、粉蕉和韭菜根系浸提液处理的FJAT-1458和FJAT-91在不同时间(2、4、8、16、32 h)的OD₆₀₀值变化，结果(图 2)表明，番茄、辣椒、粉蕉的根系浸提液及对照处理的FJAT-1458和FJAT-91的OD₆₀₀值随时间均呈升高趋势，同一时间内，番茄根系浸提液处理的FJAT-1458的OD₆₀₀值最高，辣椒次之，粉蕉和对照处理的OD₆₀₀值相当；韭菜根系浸提液处理的FJAT-1458和FJAT-91的OD₆₀₀值随处理时间呈下降趋势。

图 2 不同植物浸提液处理下菌液OD值的动态变化 Fig. 2 Effect of root extracts on OD of bacterial counts

以弱化指数为指标，测定番茄、辣椒、韭菜和粉蕉4种植物根系浸提液处理对菌株FJAT-1458和FJAT-91的致病性的影响，结果表明，这4种的根系浸提液处理下FJAT-1458和FJAT-91的平均弱化指数分别介于0.83～0.87和0.57～0.65。如表 1如示，用这4种植物根系浸提液处理2~32 h，不同时间FJAT-1458和FJAT-91的菌落弱化指数均未见显著(P>0.05)，说明这4种植物根系浸提液处理对青枯病疫苗菌株FJAT-1458和致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91的致病性没有明显的影响。

表 1(Tab.1)

表 1 不同植物浸提液处理下FJAT-1458和FJAT-91的弱化指数 Tab.1 Attenuation indices of FJAT-1458 and FJAT-91 treated by root extracts 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。 时间/h 弱化指数 番茄 辣椒 韭菜 粉蕉 对照 FJAT-1458 FJAT-91 FJAT-1458 FJAT-91 FJAT-1458 FJAT-91 FJAT-1458 FJAT-91 FJAT-1458 FJAT-91 2 0.86±0.03 5a 0.60±0.008 a 0.84±0.007 a 0.64±0.012 a 0.84±0.015 a 0.62±0.015 a 0.84±0.007 a 0.62±0.015 a 0.84±0.003 a 0.58±0.014 a 4 0.87±0.027 a 0.62±0.017 a 0.83±0.015 a 0.65±0.007 a 0.85±0.009 a 0.62±0.017 a 0.84±0.012 a 0.60±0.017 a 0.84±0.012 a 0.57±0.012 a 8 0.86±0.027 a 0.62±0.012 a 0.85±0.022 a 0.62±0.012 a - - 0.86±0.015 a 0.58±0.020 a 0.85±0.009 a 0.60±0.017 a 16 0.84±0.027 a 0.65±0.010 a 0.85±0.032 a 0.65±0.009 a - - 0.84±0.015 a 0.64±0.018 a 0.83±0.020 a 0.60±0.017 a 32 0.86±0.032 a 0.64±0.008 a 0.88±0.003 a 0.62±0.015 a - - 0.85±0.009 a 0.56±0.012 a 0.84±0.002 a 0.60±0.008 a

表 1 不同植物浸提液处理下FJAT-1458和FJAT-91的弱化指数 Tab.1 Attenuation indices of FJAT-1458 and FJAT-91 treated by root extracts

比较不同植物根系浸提液处理下青枯病疫苗菌株FJAT-1458对番茄青枯病的防治效果。结果表明，阳性对照只接种致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91处理第4 d番茄植株开始发病，至第10 d发病率达到100%，韭菜根系浸提液处理32 h的FJAT-1458接种的番茄植株第6 d开始发病，至第10 d发病率达71.67%，防效为28.33%，而番茄、辣椒和粉蕉根系浸提液处理32 h的FJAT-1458及无菌水处理32 h的FJAT-1458接种番茄植株第10 d发病率为0，防效达100%(表 2)。

表 2(Tab.2)

表 2 不同植物根系浸提液处理32 h的FJAT-1458对番茄青枯病的防效比较 Tab.2 Control efficacy of FJAT-1458 treated in root extracts for 32h 不同植物根系浸提液处理 发病率/% 防效/% 番茄 0 100 辣椒 0 100 粉蕉 0 100 韭菜 71.67±6.01 28.33±6.01 无菌水 0 100

表 2 不同植物根系浸提液处理32 h的FJAT-1458对番茄青枯病的防效比较 Tab.2 Control efficacy of FJAT-1458 treated in root extracts for 32h

大量研究表明，植物根系能够感知根系中微生物的存在，并通过根尖分泌一系列物质，诱导菌群繁殖^[17]。不同植物的根系分泌的成分差异较大，对生长在土壤中的根系微生物影响不同^{[18, 19]}。因此，研究不同植物根系浸提液对青枯病疫苗菌株FJAT-1458生长特性的影响是一项具有重要意义的工作。某些植物根系分泌物对土传病害的病原菌具有明显的抑制作用，姚琴等研究发现，韭菜根系分泌物对棉花黄萎病菌Verticillium dahliae具有明显的抑制作用^[20]；Jing报道韭菜与番茄间作，韭菜根系分泌物抑制了青枯菌Pseudomonas solanacearum侵染番茄^[21]；Gómez-Rodríguez等报道，番茄和万寿菊间作栽培方式下，万寿菊的根分泌物可以有效抑制番茄早疫病病原菌Alternaria solani孢子的萌发，大大减轻番茄枯萎的发生^[22]。本研究发现，番茄和辣椒根系浸提液对青枯病疫苗菌株FJAT-1458和致病性青枯雷尔氏菌FJAT-91的生长具有促进作用，而韭菜的根系浸提液对菌株FJAT-1458和FJAT-91的生长具有明显的抑制作用，表明韭菜根系可能存在某些分泌物质对FJAT-1458和FJAT-91有一定的抑制作用，但是具体的有效物质成分的分离纯化和鉴定有待进一步研究。

青枯菌在土壤中的存活力与土壤温度、pH值和有机质等多种因素有关^[23]。方树民等证实，前茬是非寄主植物能有效降低青枯菌的存活力^[24]。Abd EL-Ghafar在温室试验中发现前作大蒜能最大程度减少土壤中青枯菌的数量，最有效降低马铃薯青枯病严重度^[13]；前作为番茄和辣椒时，其发病率和薯块感染率都较高。方树民等研究发现不同前茬植物对土壤中烟草青枯菌数量的影响不同，诱发烟草青枯病的强度不同，表现为茄子>大豆和大蒜>花生和甘薯>玉米>水稻^[24]，本研究结果显示，非寄主植物的根系分泌物能抑制青枯菌的生长，而寄主植物根系分泌物则能促进青枯菌的生长，其中番茄的促进作用最强，粉蕉最弱，寄主植物根系对青枯菌促进作用的不同可能与植物种类、品种、发育时期等差异有关，这些差异导致了所得根系浸提液成分和浓度的不同。

刘波等构建青枯雷尔氏菌致病性的弱化指数(Attenuation index，AI)作为青枯雷尔氏菌致病力的判别指标：强致病力菌株的AI<0.65，过渡型菌株的AI值介于0.65~0.75，无致病力菌株的AI>0.75。本研究以弱化数为指标，分析番茄、辣椒、韭菜和粉蕉4种植物根系浸提液对菌株FJAT-1458和FJAT-91致病力的影响，结果发现，这4种植物根系浸提液处理对菌株FJAT-1458和FJAT-91的菌落弱化指数均无显著差异，表明番茄、辣椒、韭菜和粉蕉的根系分泌物对植疫苗菌株FJAT-1458和FJAT-91的致病力不会造成明显影响。目前利用无致病力青枯雷尔氏菌防治植物青枯病的报道较多，而根据不同寄主的特性，有针对性、合理利用无致病力青枯雷尔氏菌来防治植物青枯病具有重要意义。