谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)是含有巯基的过氧化物酶类，它与过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和超氧化物歧化酶(SOD)同样具有清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)的作用^[1]。现在已经明确动物体内的GPXs是清除ROS的主要防御酶，其清除ROS的主要酶类是谷胱甘肽过氧化物酶，根据其亚细胞定位、氨基酸序列不同以及结合底物的特异性，它又可分为几种不同的同工酶，并且GPX多数以GSH(glutathione)作为底物催化分解生物体内产生的H₂O₂。植物GPX研究比较晚，直到最近几年，在植物中才开展了GPX功能研究，植物的这些酶在结构、底物的特异性及植物组织的分布上与动物的GPX有很大的不同，但是对清除ROS、抵御外界胁迫起了很重要的作用^{[2, 3, 4]}。目前研究人员已经从龙眼、荔枝、柑橘、拟南芥、大白菜、菠菜、向日葵、番茄、豌豆、水稻、烟草、丹参等植物中分离到GPX基因^{[5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]}，但尚未见过在梨方面的报道。

福建背山面海,地形复杂,气候多样,尤其是地处中亚热带南沿内陆的闽西北山区县市冬季气温低、春季回温快、夏秋昼夜温差大,发展南方优质早熟梨具有同一纬度区域难以具备的比较优势^[13]。据2014年福建省统计年鉴统计，2013年全省梨种植面积1.38万hm²,年产量10.7万t,已成为闽西北山区县(市区)农业增效、农民增收的优势产业。然而，福建气候高温高湿，梨栽培品种病虫害易发生，抗逆性较差。豆梨属于蔷薇科梨属落叶乔木，别名鹿梨、棠梨、野梨、鸟梨等，原产我国华东、华南各地至越南，有若干变种，常野生于温暖潮湿的山坡、沼地、杂木林中，抗逆性强，可用作嫁接西洋梨、砂梨等的砧木。鉴于此，本研究首次从福建省地方梨种质资源-莆田野生豆梨幼嫩叶片里克隆GPX的cDNA全长，并对其编码的蛋白质序列进行较详细的生物信息学分析，将为进一步研究梨GPX的功能以及比较全面了解梨抗氧化体系打下基础。

本试验以福建省莆田市大洋乡采集的野生豆梨的幼嫩叶片作为试验材料。

总RNA提取按照改良的CTAB法并稍作改进^{[14, 15]}；cDNA第一链的合成按Fermentas公司RevertAid^TM First-Strand Synthesis System的试剂盒说明书进行操作。

检索GenBank上登录的GPX mRNA 或cDNA序列，设计保守区引物，设计时重点关注亚热带果树类；根据保守区测序结果参考已登录的其他物种的序列设计3′RACE以及5′RACE引物；根据拼接后的cDNA全长序列，在起始密码子处和终止密码子处设计引物，用于扩增GPX的ORF序列；引物设计、序列分析采用DNAMAN软件。本研究中使用的引物序列见表 1，引物均委托上海生物工程技术公司合成。

表 1(Tab.1)

表 1 GPX基因克隆及PCR反应中使用到的引物序列 Tab.1 Primers used in gene cloning and GPX assays 引物 序列 P1 5′-GTCAATGTTG CATCACAATG TGG-3′ P2 5′-CAGCTTCTTC ACGTCCTTCT CAAT-3′ P3 5′- CACAATGTGGCTTGACTAATTC-3′ P4 5′- CTACACAGAGTTGGCTCAGTTGTAT-3′ P5 5′- CAAACAGTCC ACCCTTGCTC GACTTC-3′ P6 5′- GCCTTGAAGC GAGTGCAGGC AAACTC -3′ P7 5′-TACCATGGGAAGCCAATCCGATCG-3′ P8 5′-TCATGCAATCCCCAACAGCTTCTT-3′ AUAP 5′-GGC CAC GCG TCG ACTAGT ACT-3′

表 1 GPX基因克隆及PCR反应中使用到的引物序列 Tab.1 Primers used in gene cloning and GPX assays

PCR反应体系为：1.0 μL cDNA，1 μL上游引物(10 μmol·L^-1)，1 μL下游引物(10 μmol·L^-1)，2.5 μL 10×PCR Buffer(含Mg²⁺)，2 μL dNTP Mix (2.5 mmol·L^-1)，0.2 μL Taq EX (5U·μL^-1)，补H₂O至总体积为25 μL。PCR扩增程序为：在94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性1 min、TM ℃退火40 s、72 ℃延伸t s，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。 PCR扩增试剂由TaKaRa公司出品。3′RACE的cDNA合成方法同1.2.1。以3′RACE的cDNA为模板进行第1轮PCR扩增，将扩增产物稀释100倍作第2轮PCR扩增的模板。

5′RACE参照Invitrogen公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version2.0的试剂盒说明书，以RT-PCR试剂盒为基础进行5'-RACE试验。其基本过程主要包括：cDNA第一链的合成，cDNA第一链加同聚物尾，在加尾的基础上进行cDNA第二链的合成，之后产物用于PCR扩增。以逆转录得到的cDNA第二链为模板用引物AUAP和P5进行第1轮PCR反应，再以此扩增产物稀释10 000倍为模板，用AUAP和P6进行第2轮PCR反应。

莆田豆梨GPX的ORF克隆是以1.2.1中的cDNA为模板，采用引物P7和P8进行PCR扩增。

采用TaKaRa公司PCR Fragment Recovery Kit回收目的片段。制得Escherichia coli DH5α感受态细胞，以TaKaRa公司的pMD-18T为载体对回收片段转化和克隆，对鉴定正确含有目的片段的大肠杆菌菌株阳性克隆子送上海生物工程技术公司进行测序。

已有序列检索使用GenBank的Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，引物设计、序列拼接及分析、内含子分析采用DNAMAN软件。获得的cDNA全长序列登录GenBank。序列推测蛋白的理化性质预测采用ExPASy ProtParam (http://www.expasy.org/tools/protparam.html)；跨膜结构预测与分析采用Tmpered (http://www.ch.embnet.org/software/tepred-form.html)；亚细胞定位预测与分析采用PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/)；蛋白质二级结构预测采用Jpred程序(http://www.compbio.dundee.ac.uk/)；蛋白卷曲螺旋结构的预测与分析采用Coils (http:// /COILS_form.html)；磷酸化位点预测与分析采用NetPhos2.0Serve (.dtu.dk/services/NetPhos/)；功能的预测与分析采用Gene Ontology annotation (.uniprot.org/uniprot/)；分子系统进化预测与分析采用DNAMAN6.0软件中Multiple alignment。

本试验所提取的总RNA样品没有呈胶状，色泽近白色说明大多数酚类、多糖、蛋白质等物质已被较彻底去除。电泳检测显示，分离得到的总RNA质量较好，28S和18S的条带比较完整，28S RNA亮度约18S RNA 2倍(图 1)；紫外分光测定、分析的结果显示，提取分离得到的总RNA，其A260 nm/A280 nm为1.94、OD260/OD230为2.12，可以看出经典的Trizol法提取的RNA质量好、纯度较高，适于后续的RT-PCR和RACE试验。

图 1 豆梨叶片总RNA琼脂糖电泳 Fig. 1 Agarose gel of total RNA extracted from leaves ofP.calleryana 注：1，2为豆梨叶片组织总RNA电泳图，其中2条亮带分别是28S rRNA和18S rRNA； M为 Marker DL2000，分子大小从上往下分别为2 000、1 000、750、500、250、100 bp。

根据GenBank上已有GPX的cDNA或mRNA序列，在最保守的区域设计引物P1和P2，以Oligo-dT12-18引物进行逆转录获得的cDNA为模板，用GPX的1对上下游引物进行PCR扩增，获得了1条与预期目标片段相符大小约400 bp的DNA片段(图 2)。测序的结果表明，该特异扩增产物的实际大小387 bp，这个序列的核苷酸和氨基酸序列分别在GenBank上经BLAST，均与数据库中已有的GPX核苷酸和氨基酸序列高度同源，其中与苹果、柑橘、龙眼、荔枝的核酸序列同源性分别有93%、92%、90%、89%，氨基酸序列同源性分别为99%、96%、95%、92%，初步推断此片段为福建省地方梨种质资源——莆田豆梨GPX的cDNA保守区部分序列。本基因在GenBank上登录，登录号为JQ011278。

图 2 豆梨叶片中GPX保守区扩增产物 Fig. 2 Amplified product of conserved region ofGPX from P.calleryana leaves 注：M为Marker DL 2 000,分子大小从上往下分别为2 000、1 000、750、500、250、100 bp。

根据已获得的莆田豆梨GPX基因保守区设计了特异的3′RACE的引物，经过2轮PCR扩增，得到了600 bp左右的单一条带(图 3-A)，与预期片段大小基本相符。第1次PCR产物不理想，条带模糊、弥散，说明扩增的效率不高，可能是3′RACE第1轮上游引物设计的不理想，存在一些非特异的扩增；而经过第2轮的扩增后，发现扩增的量明显提高，而且扩增的效果远比第1次好，说明扩增的特异性极大地提高了。测序的结果显示，3′RACE的长度为581 bp，将该片段克隆、测序后，测序结果含有设计的上下游引物，且与原有的片段具有243 bp的重叠区，有30 bp的poly(A)结构，表明所克隆的片段正是莆田豆梨GPX基因的3′末端。

图 3 豆梨叶片中GPX cDNA的3′/5′-RACE 第2轮PCR扩增结果 Fig. 3 Second round PCR of 3′ RACE and 5′ RACEofGPX from P.calleryana leaves 注：A为豆梨叶片中GPXcDNA的3′RACE 第2轮PCR扩增结果,B为豆梨叶片中GPX cDNA的5′RACE 第2轮PCR扩增结果。M为Marker DL 2 000,分子大小从上往下分别为2 000、1 000、750、500、250、100 bp。

以GPX-5′RACE-1为特异引物进行cDNA第一链合成。采用AUAP和P5、AUAP和P6分别用于第1、2轮的特异扩增。第1轮扩增获得比较模糊、弥散的条带，第2轮用第1轮的PCR产物稀释100倍后再做引物扩增得到了一条特异性好，且较稳定500 bp的条带(图 3-B)。从测序回来的结果可以看出，测序共加了37个T碱基，说明试验中加的T尾较为成功。

为了验证经过保守区，3′ RACE和5′ RACE扩增的福建省地方梨种质资源莆田豆梨GPX的cDNA全长序列，本试验还进行了GPX ORF的扩增，结果显示为500多bp明亮的特意条带(图 4)，经过克隆测序表明此片段与拼接的cDNA全长序列的相应部分全部重叠，是莆田豆梨GPX的ORF克隆，同时也证明了拼接序列的正确性。

图 4 豆梨叶片组织GPX ORF的扩增结果 Fig. 4 ORF amplification of GPX from alleryana leaves 注：M为Marker DL 2 000,分子大小从上往下分别为2 000、1 000、750、500、250、100 bp。

根据获得的5＇端序列和上述保守区、3′ 端序列，采用DANMAN6.0软件进行拼接。结果表明：莆田豆梨EC中GPX的cDNA全长为932 bp，5'UTR为204 bp，3'UTR为221 bp，有终止子TAG，区域还含有典型的加尾信号AATAA和30个poly(A)尾。拼接后的福建省地方梨种质资源莆田豆梨GPX cDNA全长序列与翻译的氨基酸序列见图 5。

图 5 莆田豆梨GPX cDNA全长序列与翻译的氨基酸序列 Fig. 5 Complete cDNA length and translated amino acid sequences for GPX gene of Putian pear 注：方框表示加尾信号，*号表示终止子。

应用生物信息学软件对莆田豆梨GPX基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析。结果表明：GPX蛋白的分子量是20 083.0 Da，理论等电点pI 5.61，是不具跨膜结构域的亲水性胞质蛋白，不具有信号肽，细胞主要定位在叶绿体基质上，有1个区域最有可能形成卷曲螺旋；蛋白质二级结构预测表明：无规则卷曲结构为主，所占的比例为54.16%，其次为α螺旋结构26.58%，而延伸构象占的比例较少，仅为19.26%。磷酸化位点有12个，其中Ser: 7个，Thr: 1个；Tyr: 4个(图 6)。对莆田豆梨胚性愈伤的GPX结构和功能进行上述的预测，可以推测福建省地方梨种质资源莆田豆梨GPX属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，有着非常保守的结构域，参与氧化还原和氧化应激反应的生物过程，参加活性氧的清除，应对胁迫等方面发挥重要的作用。此外，还对GPX酶分子三维立体结构等进行了预测和分析，从图中7可以看出，豆梨GPX三维结构主要由不规则卷曲构成，在结构中间有一个较大的凹陷，这可能是此豆梨GPX的催化活性部位，通过这个中心，酶与底物接触。用DNAMAN 6.0软件中 Multiple alignment程序对莆田豆梨与苹果、柑橘、龙眼、荔枝等其他13种不同物种的GPX氨基酸序列进行分子系统进化分析，结果如图见图 8。从图 8可以看出，13种植物12种植物聚成一大组，豆梨和苹果都属于一个科，即蔷薇科，亲缘关系较近，在进化上也靠得最近，首先聚在一起。从系统分子系统发生树还可以看出，植物之间的亲缘关系都很近，同源率在79%以上，此结果对判断物种间的亲缘关系具有一定的借鉴意义。

图 6 豆梨GPX氨基酸序列翻译后的磷酸化修饰预测 Fig. 6 Predicted phosphorylation sites in GPX amino acid sequence

图 7 豆梨GPX蛋白预测的三级结构预测 Fig. 7 Proposed 3-D molecular structure of GPX enzyme of P.calleryana based on SWISS-Model

图 8 豆梨GPX与其他物种的系统进化关系 Fig. 8 Phylogenetic relationship of GPX from P.calleryana and other species

目前，不少研究者已在多种植物上进行了GPX各种同工酶基因的分子克隆，但多集中在草本植物上，木本植物由于遗传背景较复杂，至今得到GPX基因全长的相对较少。本试验根据已有其他植物GPX保守区序列设计1对引物，用RT-PCR扩增出特异片段，在此序列信息的基础上，再设计了半嵌套引物，以3′/5′-RACE扩增成功获得cDNA全长，经过进一步的序列分析发现该序列推导的理论编码产物与已登录蛋白质数据库的其他植物GPX有很高的同源性。今后，通过基于 EST库信息或基于已有GPX的 cDNA 序列，可以进一步探讨分离 GPX其他的家族成员。

植物GPX对清除ROS和抵御外界胁迫起了很重要的作用^[1]。植物体内也存在类似于哺乳动物的GPXs家族，在拟南芥中谷胱甘肽过氧化物酶就存在8种同工酶类AtGPX128，认为植物谷胱甘肽过氧化物酶GPXs为非组成性表达，而是由环境胁迫的诱导才进行GPXs的表达，GPX及相关酶类活性的提高，可增强植物对各种环境胁迫的抗性^{[16, 17, 18]}。

经过3年的试验观察，采用的材料-莆田豆梨在野生状态下全树无病斑，叶片光滑、明亮、翠绿，抗逆性强(抗病、抗涝、抗冻与抗旱)，在10月份中旬之前没有落叶现象[19]。此外，利用生物信息学对莆田豆梨的GPX的结构和功能进行预测，推测出莆田豆梨GPX属于谷胱甘肽过氧化物酶家族，有着非常保守的结构域，参与的生物过程为氧化还原和氧化应激反应，在活性氧的清除等应对逆境胁迫方面发挥重要的作用，为下一步在真核表达系统中表达和GPX基因相关功能的研究提供了理论依据，还可将GPX基因转入中间载体后，进行转基因植物的研究，探讨外源或内源GPX基因表达对莆田豆梨抗性影响，为梨或其他植物发育调控等方面的遗传改良提供良好的目的基因资源。