灰霉菌Botrytis cinerea引起果蔬花卉的灰霉病^{[1, 2, 3]}，发病期产生大量分生孢子，可随空气、水流等传播，传统化学手段难以防治。灰霉病发病初期，首先分泌的草酸(Oxalic acid,OA)毒素可引起和增强病原菌的致病性，是重要的致病因子^[4]。草酸是有机酸中的强酸，其一级电离常数为Ka1=5.9×10^-2、二级电离常数为Ka2=6.4×10^-5。故而灰霉菌分泌的草酸瞬时降低了植物侵染区域的pH，一方面使灰霉菌中几种细胞壁降解酶产生活性，另一方面抑制植物防卫反应中氧爆作用(oxidative burst)的发生^[5]。木霉Trichoderma spp.生防菌可防治黄瓜、番茄等多种作物的灰霉病，具有较好的应用前景^{[6, 7, 8]}。近年，研究发现木霉具有消除草酸的生防效应。木霉S7对油菜菌核病Sclerotinia sclerotiorum具有拮抗作用，其提取物中表现明显的草酸氧化酶(oxalate oxidase,OXO)活性，培养1 h可降解23%草酸^[9]。绿色木霉T. viride TvB1、哈茨木霉T. harzianum ThB1及康宁木霉T.koningii可显著降低整齐小核菌S. rolfsii产生的草酸，并直接导致白绢病发病率的降低^[10]。那么在木霉拮抗灰霉菌和防治灰霉病的作用中，是否也存在类似的生防作用？由此，本研究分析了木霉拮抗灰霉菌作用中对pH的影响及消除草酸的作用，以期为深入了解木霉防治灰霉病机制奠定基础。

菌株哈茨木霉T.harzianum LTR-2(分离自土壤)和灰霉菌Botrytis cinerea S31(分离自黄瓜)均由山东省应用微生物重点实验室分离并保藏。另外的58株木霉菌由山东省应用微生物重点实验室从野外采集的土壤样品中筛选分离并保藏。

取4 d龄LTR-2的培养平板，用无菌接种针轻轻刮下分生孢子，悬浮在含有0.01% triton的无菌水中，滤纸过滤，制成分生孢子浓度为10⁷ cfu·mL^-1的孢子悬浮液。培养基为PD培养液，115℃ 90 kPa灭菌20 min。分别往培养液中添加一定量的过滤除菌的0.5 mol·L^-1草酸的水溶液，使草酸在培养液中的终浓度分别为0、10、20、50、80、100 mmol·L^-1。各处理间除草酸浓度改变，其他成分浓度不变。将含不同浓度草酸的培养液分装在500 mL三角瓶中，每瓶100 mL。将100 μL木霉分生孢子悬浮液接种至各处理培养液中(分生孢子初始浓度为10⁴cfu·L^-1)，以含有不同浓度草酸，但不接种木霉(以100 μL含有0.01% triton的无菌水代替)的培养液为对照。将三角瓶置于25℃摇床中振荡培养12 d(160 r·min ^-1)。将培养混合物经灭菌滤纸抽滤，滤液用pH酸度计参照王桂芝的方法^[11]进行pH测定。

参考Ren等的方法^[12]，针对木霉和灰霉的生长特性，培养条件和取样方式进行适当调整。具体步骤如下：取4 d菌龄的灰霉菌饼(直径5 mm)，倒扣置于PDA平板(直径9 cm)上，25℃暗培养 1 d，取3 d菌龄的木霉菌饼(直径5 mm)倒扣接种于距灰霉接种点6 cm的培养基上，再将平板继续置于25℃暗培养3 d。并设仅接种木霉(灰霉菌饼处由PDA琼脂块替代)、仅接种灰霉(木霉菌饼处由PDA琼脂替代)、不接种菌饼(由PDA琼脂块替代)的3种PDA平板，重复5次。在PDA平板上两个接种点之间的区域取3个位置：位置I，距木霉接种点(或替代的PDA琼脂接种块)1 cm处；位置II，木霉和灰霉菌交界处(木霉或灰霉的菌丝外缘处)；位置III，距灰霉接种点(或替代的PDA琼脂接种块)1 cm处。共培养3 d后，用pH精密试纸(生工? )分别检测各位置(测定相同距离的10个点取平均值)培养基的pH。

参考Ren 等的方法^[12]，针对木霉和灰霉的生长特性，培养条件和接菌量进行适当调整。取3 d龄的木霉和5 d龄的灰霉培养平板，用无菌接种环轻轻刮下分生孢子，悬浮于含0.01%triton的无菌水中，滤纸过滤菌丝，得到分生孢子悬浮液。血小板计数法将木霉和灰霉菌的分生孢子悬浮液浓度调整为2×10⁶ cfu·mL^-1。分别取盛花期黄瓜连体花瓣[挑选的连体花瓣充分伸展后最长直径为(65±5) cm]和刚伸展的幼叶[挑选的叶脉长度为(65±5)cm]，用70%乙醇表面消毒30 min，使用无菌水冲洗2次去掉残余的酒精，将连体花瓣和幼叶正面朝下充分平展于水琼脂平皿表面，每皿分别放1个连体花瓣和1片叶片。先在植物组织朝上面涂抹20 μL灰霉菌分生孢子悬浮液，超净台中无菌风吹2 h，待多余水分挥发后，再在同面涂抹木霉分生孢子悬浮液。设单独接种灰霉的处理，并用含0.01%Triton的无菌水代替木霉接种。各处理接种5个培养皿。将这些培养皿在25℃暗培养4 d后，用pH精密试纸(生工? )检测植物组织周围(测定周围10个点取平均值)培养基的pH。

对于单独用灰霉处理的花瓣和叶片，在培养4 d后，再涂布木霉分生孢子悬浊液(2×10⁶ cfu·mL^-1)，继续培养至6 d。用pH精密试纸(生工? )检测植物组织周围(测定周围10个点取平均值)培养基的pH。

参考Ren 等的方法^[12]，在黄瓜叶片上进行对峙情况下草酸含量的测定。在黄瓜盛花期，选取刚伸展的叶片(大小同1.2.3)，洗净后吸干水滴，正面朝下平展于塑料皿内平铺的湿吸水纸上，每皿一片叶片。在朝上面涂布木霉分生孢子悬浮液(浓度为1×10⁶ cfu·mL^-1)，每叶片涂1 mL，在超净台中无菌风吹2 h。将3 d龄的灰霉菌饼接种于叶片表面，每个叶片接种一块。同时接种两菌的处理命名为B+T。同时设仅涂布木霉孢子悬浮液(灰霉菌饼由PDA琼脂块替代)的处理T，仅接种灰霉菌饼(木霉接种替换为涂布含0.01%Triton的无菌水)的处理B和无菌(涂布含0.01%Triton的无菌水和放置PDA琼脂块)的处理Null 3个处理。每个处理封口保湿，置于25℃下培养4 d，设5个重复。

培养4 d后，分别记录并统计各处理的灰霉病发病率，计算公式为发病率=N^d/N^a×100%，其中N^d表示各处理中发病的叶片数，N^a表示各处理叶片总数。测量发病叶片的病斑直径，病斑直径的测量方法为以接种菌饼处为中心，每隔36°取1条直线，共取10条直线，分别测量直线中病斑对向边界所截取的线段的长度，取10个线段长度的平均值即为1个病叶的病斑直径，最后统计各处理的病斑直径范围。收集各处理叶片接种点周围的病组织(命名为D)和非病组织(命名为N)，其中处理T、Null和未发病的T+B叶片中取接种块附近半径为1 cm内的叶组织定义为病组织对照，其余部分为非病组织对照。将各处理的病组织置于50℃恒温烘箱中烘烤至干燥。并在研钵中研成粉末，称重。将各处理粉末溶于100 mL蒸馏水中，80℃水浴6 h。将上述混合液在4 000 r·min^-1转速下离心5 min，去掉残渣，得到草酸待测液。用高锰酸钾滴定法测定草酸含量^[10]。

对峙培养方法参照1.2.2，其中的木霉菌株为58株野外采集的木霉菌株，培养时间延长至5 d，以只接种灰霉菌饼作为对照。培养结束时测量菌生长直径，计算抑菌率。计算公式为灰霉抑菌率=(D-d)/D×100%，其中D表示对照灰霉菌生长直径，d表示对峙灰霉菌生长直径(被木霉覆盖生长的部分不计入)。

使用Excel 2007软件对数据结果的平均值和标准差进行分析，使用OriginPro 8.5进行数据进行图表化处理和Pearson相关性分析，使用SPSS 19.0对数据结果的显著性差异进行Duncan′s多重检验。

木霉LTR-2在含不同浓度的草酸处理的PD液体摇瓶中培养，对环境pH的影响如图 1-A所示，不添加草酸时，PD培养液的初始pH为5.89，同样条件振荡12 d后，pH为6.05，无显著变化；接种LTR-2的初始pH为5.90，培养12 d的pH为5.93，LTR-2的培养没有对培养液pH产生明显影响。添加10 mmol·L^-1草酸时，无菌振荡的培养液的pH由初始的4.27到培养结束的4.25，一直保持弱酸性；接种LTR-2后，培养液的pH由4.28升高为5.48，差异显著。添加20 mmol·L^-1草酸时，无菌振荡的培养液的pH由初始的3.67到培养结束的3.55，进一步酸化；接种LTR-2可使pH由初始的3.70上升至5.85，差异显著。添加50 mmol·L^-1草酸时，无菌振荡的培养液的pH由初始的2.37到培养结束的2.15，呈强酸性；接种LTR-2并培养12 d，培养液pH由初始的2.33上升至5.10，差异显著。但在分别添加80 mmol·L^-1和100 mmol·L^-1草酸浓度下，木霉的生长受到严重抑制，在培养时间长达12 d时，对环境pH的影响不明显。上述结果可用溴酚蓝(Bromophenol blue)酸碱指示剂进行直观显示(图 1-B)，溴酚蓝的变色范围为3.0(黄色)至4.6(紫色)。

图 1 哈茨木霉LTR-2在不同浓度草酸处理下培养后的培养液pH变化 Fig. 1 pH of LTR-2 culture filtrate with varied OA concentrations 注：A为哈茨木霉LTR-2在不同浓度草酸处理下培养后的培养液pH测定，图中PDA表示PDA培养基，T表示接种木霉培养，数字表示培养液含草酸的浓度(mmol·L-1)；本数据为3次重复的平均值和标准差，数据经Duncan′s多重检验，以P<0.05作为差异显著标准。B为A处理中用溴酚蓝指示不同pH培养液的颜色变化。

前期结果证明，哈茨木霉LTR-2具有耐受和消除草酸的能力。本研究上述结果表明，在<50 mmol·L^-1草酸浓度下，LTR-2经过充分的培养后，可将培养液pH提高至5.10~5.85。

PDA平板培养条件下，木霉LTR-2和灰霉菌对峙对环境pH的影响结果表明，PDA的初始pH为6.00，培养条件下放置4 d后，pH下降至5.50。各处理的初始pH一致。单独接种灰霉菌培养4 d后，灰霉菌的菌落半径为4.0 cm。灰霉菌接种点附近的培养基pH为3.38，菌落边缘处pH为3.50，灰霉接种点对向的木霉接种处(以PDA琼脂块替代)的pH为5.00。单独接种木霉菌块3 d后，木霉菌落半径为6.5 cm，木霉接种点附近pH为4.50，菌落边缘处pH为4.70，木霉接种对向的灰霉接种处(以PDA琼脂块替代)的pH为4.80。接种木霉和灰霉菌块的平板共培养3 d后，木霉的菌落半径为6.35 cm(其中包括生长覆盖部分的0.85 cm)，灰霉的菌落半径为2.45 cm，木霉菌块附近位置的pH为4.92，两菌交界处和灰霉菌块附近位置pH均为4.00(图 2)。

图 2 木霉与灰霉菌在PDA上对峙培养4 d的培养基pH Fig. 2 pH of PDA culture medium after 4-day co-culture of LTR-2 and B.cinerea 注：①B+T表示木霉与灰霉菌在PDA中对峙培养，T表示木霉在PDA中单独培养，B表示灰霉菌在PDA中单独培养，Null表示无菌PDA平板。②图中数据为5次重复的平均值和标准差，数据经Duncan′s多重检验，以P<0.05作为差异显著标准。图 4和图 6同。

以上数据表明，在PDA上培养的灰霉菌，菌丝延伸过程中造成了环境pH的降低，位置II、III的下降幅度分别为2.12和2.00，位置I由于没有灰霉菌丝生长pH下降不明显。而木霉的培养同样使环境更偏向于酸性，但pH的降低幅度较小，为0.70~1.00。木霉和灰霉菌的对峙培养，缓解了灰霉对环境的酸化，其中位置III的pH比仅灰霉的pH上升了0.62，位置II上升了0.50。

为分析木霉拮抗灰霉菌与环境pH变化有无相关性，对野生木霉菌株的灰霉抑制率进行测定，并用本文2.2的相同的方法测定并统计对峙平板中位置III的pH，对数据进行Pearson 相关性分析，结果表明，培养初始pH为6.50，在同样的培养条件下4 d后pH无变化。作为抑制率测定对照处理的单独培养灰霉菌4 d后，灰霉菌饼1 cm处(位置III)培养基的pH下降至3.30。灰霉菌与58株木霉进行对峙培养4 d后，灰霉菌饼1 cm处(位置III)的pH最高为7.50，最低为3.00。抑菌率分析结果表明，58株木霉对灰霉的抑制率中，最高为90.56%、最低为1.12%。Pearson相关性分析结果表明，木霉对灰霉的抑制率越高，pH回升的幅度越大。Pearson相关系数earson相关系数r值为0.856 63，可线性拟合，拟合系数Adj.R-Square为0.728 97。两者呈显著相关，并且高度线性正相关(图 3)。结果表明木霉对灰霉的抑制率与环境pH提高有显著的相关性。

图 3 对58株木霉菌株的灰霉抑制率和pH的Pearson相关性分析 Fig. 3 Pearson correlation between inhibition rates of 58 Trichoderma strains on B.cinerea and plant ambient pHs

将黄瓜花瓣和叶片平铺于水琼脂上，分析木霉LTR-2和灰霉菌对峙培养对植物组织周围水琼脂pH的影响，结果表明，水琼脂的初始pH为4.00，呈弱酸性，培养条件下放置4 d后，pH无变化。分别放入黄瓜花瓣和叶片后，周边琼脂中的初始pH与终pH与无明显变化。各处理的初始pH一致。在花瓣上涂布灰霉孢子悬浮液，培养4 d后，植物组织发病，环境pH为2.50，由弱酸性变为强酸性。同样的情况也出现在叶片处理中，环境终pH为2.00。与在PDA平板中培养的结果不同，单独涂布木霉孢子悬浮液，反而使环境pH上升。在与黄瓜花瓣和叶片共培养4 d后，环境pH分别为4.75和5.00。同时接种木霉和灰霉菌后，植物组织病情较弱，环境pH呈上升趋势，培养4 d,花瓣和叶片周边环境pH均由4.00提高到5.00(图 4)。

图 4 木霉与灰霉菌在黄瓜花瓣和叶片上对峙培养的环境pH Fig. 4 Ambient pH after LTR-2 and B.cinerea co-culture on cucumber petals and leaves 注：①B+T表示涂布了木霉和灰霉菌的花瓣和叶片，T表示仅涂布木霉的花瓣和叶片，B表示仅涂布灰霉菌的花瓣和叶片，Plant tissue表示无菌的花瓣和叶片，B+T’表示先涂布灰霉菌再涂布木霉的花瓣和叶片。②*表示先单独培养灰霉菌4 d，再接种木霉并培养至6 d。

花瓣和叶片是灰霉菌侵染植物的门户，在不添加营养成分的水琼脂中，以植物器官作为基质，更接近病害实际发生时的状态。对比在PDA中培养的结果，相似之处是灰霉菌的生长都酸化了环境，木霉与灰霉菌的共培养缓解了酸化作用。不同的是，在植物组织中，木霉单独培养提高了环境pH。从上述结果看，在初始环境pH分别为6.00和4.00时，LTR-2的单独培养均可将pH保持在5左右，提示 LTR-2可能还可以通过自主调节的方式稳定环境pH，该机制也许与消除草酸协同作用。

木霉与灰霉共培养时，也许会出现因营养竞争、重寄生等造成的灰霉生长受严重抑制而无法正常分泌草酸的情况，故而进一步对已经定殖了灰霉的花瓣和叶片再接种木霉，接种方法相同。继续培养到6 d后，植物组织周围的pH也被大幅度提高至4.55和4.75。证明木霉的定殖可以有效缓解灰霉造成的酸化环境(图 4)。

如表 1所示，涂布木霉LTR-2孢子悬浮液有效降低了黄瓜叶片的发病率。只接种灰霉菌饼的黄瓜叶片全部发病，同时接种了木霉和灰霉菌植物组织发病率降低至16.70%。同样发病的情况下，接种木霉的病斑直径明显缩小。同时，只接种木霉和不接菌的叶组织不发病。叶片在4 d的发病情况如图 5所示。

表 1(Tab.1)

表 1 不同处理下黄瓜叶片的发病率与病斑直径(培养4 d) Tab.1 Gray rot incidence and diseasedspot diameter on cucumber leaves under different treatments (cultured for 4 days) 注：B+T表示涂布木霉孢子液和接种灰霉菌饼，B表示仅接种灰霉菌饼，T表示仅涂布木霉孢子液，Null表示无菌处理。 处理 黄瓜叶片发病率% 病斑直径cm B+T 16.70 0.0~1.4 B 100.00 3.1~4.7 T 0 0 Null 0 0

表 1 不同处理下黄瓜叶片的发病率与病斑直径(培养4 d) Tab.1 Gray rot incidence and diseasedspot diameter on cucumber leaves under different treatments (cultured for 4 days)

图 5 不同处理下黄瓜叶片的发病情况(培养4 d) Fig. 5 Gray rot on cucumber leaves under different treatments (cultured for 4 days) 注：B+T表示涂布木霉孢子液和接种灰霉菌饼，B表示仅接种灰霉菌饼，T表示仅涂布木霉孢子液，Null表示无菌处理。标尺长度为1 cm。

分别对各处理叶片病组织和非病组织进行了草酸含量测定，结果(图 6)显示叶片中草酸含量分别为33.30、46.17 mg·g^-1。单独涂布木霉分生孢子悬浮液后，草酸含量分别为33.13、35.06 mg·g^-1，草酸含量降低不显著。单独接种灰霉菌块后，病组织的草酸含量高达131.25 mg·g^-1，非病组织也提高至54.49 mg·g^-1。在涂布了木霉的叶片上接种灰霉菌饼后，病组织的草酸含量为67.20 mg·g^-1，非病组织的草酸含量为46.62 mg·g^-1。

图 6 不同处理下黄瓜叶片组织的草酸含量 Fig. 6 OA content on tissue of cucumber leaves under different treatments 注：B+T表示涂布木霉孢子液和接种灰霉菌饼，B表示仅接种灰霉菌饼，T表示仅涂布木霉孢子液，Null表示无菌处理。(D)表示病组织或病组织对照区，(N)表示非病组织或非病组织对照区。

在涂布了木霉分生孢子悬浮液的叶片组织上，灰霉菌的致病力被严重抑制，并且伴随着草酸含量的显著降低。结果表明木霉在防治灰霉病的过程中，存在消除草酸的作用。

多项研究成果表明，草酸是灰霉菌、菌核菌等草酸分泌型病原菌的重要致病因子^{[13, 14, 15]}。灰霉菌突变体A336无法正常合成草酸，进而丧失了对寄主植物的致病性^[16]。草酸乙酰水解酶(Oxaloacetate acetylhydrolase)基因功能丧失的菌核菌突变体无法产生并积累草酸，进而对寄主植物的损害降低^[17]。草酸的主要功能是创造酸性环境，激活病原菌的酶活，但抑制植物防御体系的酶系，营造利于侵染、进入植物组织体内的有利条件。侵染中过程中，pH分别调控了灰霉菌多种致病因子的分泌，比如聚半乳糖醛苷酶(Polygalacturonases)、漆酶(Laccases)等^[18]。曾有通过喷洒碳酸钙中和草酸的病害防治方法，见效快，但治标不治本。

本研究采用的哈茨木霉T.harzianum LTR-2^[19]对蔬菜灰霉菌有显著的拮抗效果，在28℃对峙培养5 d，抑菌带直径为10.0 mm。LTR-2可湿性粉剂在田间可有效防治番茄、茄子、五彩椒、辣椒、扁豆和黄瓜6种蔬菜灰霉病，防效为71%～81%^[20]。前期研究表明相较许多木霉菌株，哈茨木霉LTR-2具有优秀的耐受并消除草酸的能力，PD液体培养12 d后可在< 30 mmol·L^-1草酸浓度条件下消除80%以上的草酸^[21]。本研究表明，哈茨木霉LTR-2在<50 mmol·L^-1草酸浓度下经过12 d培养后，可将培养液pH提高至5.10~5.85。LTR-2不仅可在与灰霉菌的对峙培养中提高环境pH，并且在黄瓜花瓣和叶片上也可缓解灰霉对环境的酸化作用，并进一步证明LTR-2在黄瓜叶片上与灰霉菌的对峙使草酸含量下降。另外，研究还发现，木霉的灰霉抑制率与环境pH的提高幅度间有显著相关性，暗示草酸消除作用是木霉防治灰霉病的关键机制之一。哈茨木霉LTR-2可通过消除草酸，缓解草酸对环境的酸化作用，并有效抑制病害的发生，表明对作用机制的进一步探索具有现实意义。本研究充实了木霉防治灰霉病的研究方向，为将消除草酸作为靶标，筛选高效专型的木霉生防菌提供理论依据。