铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo为我国传统名贵药材之一，被中医药界誉为“植物大熊猫”。自2008年，铁皮石斛产业发展很快，目前南方各省都有种植，种植的方式大部分为大棚栽种。目前，生产上人工集约规模种植铁皮石斛的主要病害有白绢病、软腐病、黑斑病、炭疽病等，给企业和种植户造成了不少的损失。

白绢病(Souther Blight)的病原为齐整小核菌Sclerotium rolfsii Sacc.。据报道，全世界有超过500种以上的寄主能被该病原菌侵染^[1]，植株受侵染后，常引起作物根及根茎腐烂^[2]和大量死苗^[3]，造成巨大损失。为了更好地满足市场对铁皮石斛日益增长的品质需求，在对铁皮石斛病虫害的防治技术上，应选择高效低毒无公害的药剂。因此本研究在对侵染铁皮石斛白绢病进行分离鉴定的基础上，进一步选用5种药剂进行室内菌丝生长抑制试验，以期为生产上防治该病提供理论依据。

2014年12月于福建省农科院甘蔗研究所温室大棚采集发病典型的病株，置于自封袋中带回实验室分离。

选择具有典型病症状的新鲜铁皮石斛茎部作为分离材料，无菌水冲洗30 min，切成1~2 cm茎段，50%次氯酸钠溶液表面消毒1 min，再用无菌水冲洗3次，转入PDA培养基，轻轻按压，每个培养皿4~5块，28℃培养3~4 d。将新鲜菌丝打孔，再接种到PDA培养基中进行繁殖。

根据柯赫氏法则，对分离得到的病菌进行致病性测定，接种后将铁皮石斛植株放置28℃培养箱中，3 d后观察发病情况。

将PDA平板培养基上菌丝块接种到200 mL液体PDA培养基中，28℃、160 r·min^-1培养2~3 d，抽滤收集菌丝，灭菌水冲洗数次，灭菌滤纸吸干水分。采用CTAB法提取DNA^[4]，-20℃保存备用。

应用真菌18S rDNA的ITS区域PCR扩增的通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，进行PCR扩增，PCR 反应体系为：模板DNA 1.0 μL,10 ×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol·μL^-1)1.0 μL，ITS1/ITS4(10 mmol·μL^-1)各1.0 μL,rTag聚合酶(5 U·μL^-1)0.1 μL，ddH₂O 18.4 μL。PCR反应程序为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s，30个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用上海生工凝胶纯化试剂盒对DNA片段进行回收，连接到pMD19-T载体，转化至大肠杆菌HB101中。菌液PCR检测阳性后，送上海生工公司进行测序。测序结果在GenBank中进行序列比对并下载相关序列，利用DNAMAN 5.0进行分析，用MEGA 6.0软件的Neighbor-Joining构建系统进化树。

供试药剂名称及浓度见表 1。

表 1(Tab.1)

表 1 供试药剂名称及用量 Tab.1 Namesand concentrations of fungicides tested 药剂名称 产家 建议用量倍 5个稀释倍数倍 多利维生 捷克生物制剂有限公司 7500~10000 6000，7000，8000，9000，10000 80%乙蒜素 开封大地农化生物科技公司 5000~6000 3000，4000，5000，6000，7000 三唑酮 上海升联化工有阴公司 800~1000 600，700，800，900，1000 百菌清 山东罗邦生物农药有限公司 500~600 300，400，500，600，700 奥力克-霉止 潍坊奥丰作物病毒防治有限公司 300~600 200，300，400，500，600

表 1 供试药剂名称及用量 Tab.1 Namesand concentrations of fungicides tested

将供试药剂先用灭菌水按比例进行混合溶解后，加入放置到室温的PDA培养基中进行倒板。每种药剂设5个浓度梯度(表 1)，以不添加药液的PDA平板为空白对照，设3重复。将5 mm菌饼置于含不同浓度供试杀菌剂的PDA平板上，在28℃恒温培养箱全黑暗培养，3d后用十字交叉法测量菌落直径，用DPS软件进行统计分析。

抑菌率(％)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径一菌饼原始直径)× 100％。

病原菌在PDA培养基上培养2~3 d后，菌落致密，表生绒毛白色。经过5 d培养后，菌丝上长出白色菌核，7~8 d后菌核为浅至深褐色(图 1)。

图 1 白绢病病原菌的菌落形态(PDA) Fig. 1 Colony morphology of pathogenic fungus of Southerblight on D.officinale on PDA 注：A为菌丝，B为菌核。

将纯化培养后的病原菌，回接到铁皮石斛的健康叶片及茎杆上，在28℃温度下保湿培养。接种后的第4 d开始发病，叶片成水渍状，白色菌丝紧贴于组织表面，接种5 ｄ后产生白色菌核，后渐变成棕褐色菜籽状小菌核(图 2)，症状表现与田间侵染后的表现症状相同，对照植物上无发病症状。从接种的病组织分离的病原菌与田间发病组织分离的病原菌形态一致。

图 2 白绢病病原菌的致病性测室 Fig. 2 Pathogenicity test of Southerblight on D.officinale 注：A为健康植株，B为发病植株。

以提取的病原菌DNA为模板，利用通用引物进行rDNA-ITS序列扩增。经测序后获得500 bp左右的序列,命名为Do-1。将序列登录GenBank进行同源性比较分析，结果表明，该序列与 Genbank罗氏阿太菌(Athelia rolfsii，登录号：HQ420816.1)的序列相似性达到100％，罗氏阿太菌的无性型为齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)。选取其中相近种的rDNA-ITS序列，经MEGA 6.0进行多序列比对并用Neighbor-Joining法构建系统发育树(图 3)。结果表明,供试菌株与阿太氏菌属的ITS序列的分支支持率<60，全部聚为一类。结合供试菌株的形态特征和分子检测结果表明，病株的病原为齐整小核菌，引致的病害即为白绢病。

图 3 基于18S rDNA的ITS构建的系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of pathogen causedsouthern blight on D.officinalebased on 18S rDNA -ITS sequences 注: 前面为真菌的分离物名，后面为相关真菌在 GenBank 上的登记号。

植物病虫害的无公害防治在药剂上选择高效低毒的安全农药，而生物防治主要是采用拮抗微生物降低病原菌的密度，本试验选择的多利维生、80%乙蒜素、奥力克-霉止都是安全的生物农药，对园艺、蔬菜等作物的真菌类病害具有显著的抑制作用。本研究结果表明，多利维生与80%乙蒜素对白绢病的抑菌率在87%以上，奥力克-霉止的抑菌率最低。经方差分析结果表明，多利维生与80%乙蒜素的不同浓度之间不存在显著差异，与百菌清、三唑酮存在极显著差异。多利维生与80%乙蒜素抑制白绢病菌的生长效果与对照相比达极显著水平(表 2)。

表 2(Tab.2)

表 2 5种杀菌剂对铁皮石斛白绢病菌的相对抑制率 Tab.2 Relative inhibitory rate of 5 fungicides against pathogen causedsouthern blight on D.officinale 杀菌剂 药剂稀释倍数倍 菌落直径cm 抑菌率/%(显著性) 多利维生 6000 0.17 91.23 jIJ 7000 0.30 88.42 ijIJ 8000 0.23 89.82 jIJ 9000 0.30 88.42 ijIJ 10000 0.30 88.42 ijIJ 80%乙蒜素 300 0.10 92.63 jJ 400 0.17 91.23 jIJ 500 0.30 88.42 ijIJ 600 0.33 87.72 ijIJ 700 0.23 89.82 jIJ 三唑酮 600 0.20 90.53 jIJ 700 0.77 78.60 hiHI 800 1.17 70.18 ghGH 900 1.20 69.47 ghGH 1000 1.53 62.46 gG 百菌清 300 1.57 61.75 gFG 400 2.20 48.42 fEF 500 2.53 41.40 efDE 600 2.20 48.42 fEF 700 2.70 37.89 deDE 奥力克-霉止 200 3.13 28.77 cdCD 300 3.53 20.35 bcBC 400 3.87 13.33 bAB 500 3.67 17.54 bBC 600 3.93 11.93 bAB CK 4.50 0.00 aA

表 2 5种杀菌剂对铁皮石斛白绢病菌的相对抑制率 Tab.2 Relative inhibitory rate of 5 fungicides against pathogen causedsouthern blight on D.officinale

关于铁皮石斛白绢病菌的分离鉴定，很少见有文献报道。但齐整小核菌Sclerotium rolfsii 引起的其他作物白绢病的报道较多,包括中药材如白术、金线莲、药水等，在不同地区引起不同作物的白绢病^{[5, 6, 7]}。

目前，应用rDNA-ITS序列分析已成为植物病原真菌分类鉴定研究中一种重要手段。本研究应用rDNA-ITS序列分析和病原的形态特征相结合，确定引起铁皮石斛白绢病的病原菌为齐整小核菌Sclerotium rolfsii Sacc.，分子检测与致病性测定结果相互印证，进一步增强了病原鉴定结果的可靠性。

在生产上防治白绢病病目前仍以化学防治为剂为主，由于铁皮石斛作为可鲜食的中药材的特殊性，在病虫害的防治方面的研究逐渐向植物源农药和生物防治方面发展。在对白绢病菌的防治上，国内也有研究，如哈茨木霉^[7]、绿色木霉^[8]等，目前本研究筛选出的多利维生与80%乙蒜素，其中多利维生是寡雄腐霉登记注册的微生物农药产品，80%乙蒜素是植物杀菌剂，对白绢病菌的抑制效果明显，抑制率均可达87%以上，可为生产上防治白绢病提供理论依据。