建兰Cymbidium ensifolium为兰科兰属地生兰植物，是国兰最主要的种类之一，其叶姿优美、花香清幽、花期长，既能赏花又能观叶，花期能跨越四季，故又称之为“四季兰”，素心建兰是其中较为珍贵的品种类型，具有很高的观赏价值和经济价值。植物学界以建兰主产地为福建而命名，是国兰中唯一以省份名称命名的种类^[1]，是福建省重要特色商品花卉，商业化开发潜力大。目前，国内大部分国兰种植企业繁育种苗仍以传统分株繁殖为主，存在种源有限、繁殖效率低、种性退化及易携带病毒等问题，无法满足大规模的产业化生产需要。而利用种子无菌播种进行种苗快速繁殖无疑是较为理想的一种产业化繁殖方式^{[2, 8]}。目前，有关建兰的组织培养研究主要集中在茎尖、腋芽诱导根状茎及其无菌材料的增殖分化方面^{[9, 14]}，而素心建兰种子无菌播种快繁技术鲜为报道^[15]。建兰种子数量多，种子非常细小，自然条件下很难萌发，除了种胚发育不完全，仅含脂类作为储存营养物质，几乎无胚乳之外，还与种皮致密，透性差以及种子本身含有抑制种子萌发的物质等因素有关，使得萌发比洋兰更难。为此，本研究通过组织培养手段，创造有利条件，进行素心建兰种子无菌播种，促使种子萌发获得根状茎，并探讨根状茎增殖、分化培养条件，旨在探索素心建兰无菌播种快繁技术，为其种苗工厂化生产提供技术基础。

以八成熟的素心建兰‘铁骨素’ Cymbidium ensifolium var.susin‘Tiegusu’自交蒴果为供试材料，从其蒴果中收集种子作为外植体进行种子的无菌萌发。试验在福建省特色花卉工程技术研究中心花卉育种实验室进行。

在超净工作台上，先用75％酒精擦洗蒴果表面，然后放入0.1%升汞溶液中浸泡消毒12 min (浸泡过程中不时用手轻轻摇动容器)，取出后用无菌水冲洗5次，再用无菌纸吸干水分，在接种盘上切开果荚，将种子均匀撒播在培养基表面。

以1/2MS为基本培养基，分别添加活性炭(AC) 1.0 g·L^-1、水解乳蛋白(LH)2.0 g·L^-1、6-BA3.0 mg·L^-1 、NAA 0.5 mg·L^-1组合，并附加琼脂粉6.0 g·L^-1、蔗糖30 g·L^-1，pH 5.8，对种子进行无菌萌发。

采用3因素3水平L9 (3³)正交设计，选择基本培养基、TDZ、NAA为试验因素，代号分别为A、B、C各设置3个水平(表 1)。各处理培养基均附加白糖30 g·L^-1、琼脂粉6.0 g·L^-1、AC 0.5 g·L^-1。每处理接种10瓶，每瓶接种8段(每段长度0.5~0.8 cm)，3次重复，共9个处理。用称重法称量根状茎鲜重，分别于接种前、后及增殖后称重，接种时根状茎鲜重为接种前、后差值，增殖系数=(增殖后根状茎鲜重-接种时根状茎鲜重)/接种时根状茎鲜重

表 1(Tab.1)

表 1 L9 (33 ) 因素及水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal design L9 (33 ) 编号 A：基本培养基 B：TDZ /( mg·L-1) C：NAA /( mg·L-1) 注：花宝1号用量3.0 g·L-1，改良1号为改良MS，即大量元素减半(除氯化钙全量外)，其他不变，并添加花宝1号1.5 g·L-1配置而成。 1 MS 0.1 0.2 2 花宝1号 0.5 0.5 3 改良1号 1.0 1.0

表 1 L9 (33 ) 因素及水平 Tab.1 Factors and levels of orthogonal design L9 (33 )

以改良1号为基本培养基，添加6-BA2.0 mg·L^-1 、NAA (0.1、0.5 mg·L^-1)组合及不添加激素3个处理，并附加琼脂粉6.0 g·L^-1、白糖30 g·L^-1，pH 5.8，对根状茎进行分化培养。每处理接种10瓶，每瓶接种8段(每段长度0.5~0.8 cm)，3次重复。芽分化率=(分化出芽体的根状茎数/接种根状茎数) ×100%。

切取单芽接入1/2MS + IBA0.5 mg·L^-1 +白糖20 g·L^-1+琼脂粉6.0 g·L^-1+AC 0.5 g·L^-1壮苗生根培养基中进行生根诱导，并进行移栽种植。

采用固体培养基培养方式，以220 mL的组培瓶为培养容器，每瓶培养基用量20~30 mL，pH值5.8，培养温度(24±3)℃，种子无菌播种阶段采用暗培，其他阶段光照强度2 000~2 500 lx，光照时间12 h·d^-1。

采用正交设计助手V3.1软件进行分析^[16] 。

种子在诱导培养基上暗培养4个月后陆续有绿色芽点出现，芽点类似于桑果的球状突起(图 1-A)，随着培养时间的延长球状突起不断伸长，发育成瘤状根毛状体,形成了根状茎，根状茎表面覆有白色绒毛(图 1-B)。从表 2可以看出，采用不同培养基配方，种子萌发时间、萌发效果各异，无激素培养基对种子萌发不利；培养基配方1/2MS+6-BA3.0 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1+LH 2.0 mg·L^-1+AC1.0 g·L^-1的培养基对种子萌发效果较好。

图 1(Fig. 1)

图 1 素心建兰无菌播种快繁过程及生长情况 注：A、B为无菌萌发，C为根状茎增殖，D为根状茎分化， E为试管苗生根，F为试管苗移栽。 Fig. 1 Growth of aseptic sowing and rapid propagation process for Cymbidium ensifolium var.susin

表 2(Tab.2)

表 2 不同培养基对素心建兰种子萌发的影响Tab.2 Table 2 Effect of media on seed germination of C.ensifolium var.susin 处理 培养基 萌发时间/d 萌发效果 注：建兰种子很小，无法准确计算出萌发率,以“+”描述萌发效果，“+”越多，表明萌发效果越好。 1 1/2MS+AC1.0 g·L-1 210~240 + 2 1/2MS+LH 2.0 g·L-1 +AC1.0 g·L-1 180~210 ++ 3 1/2MS+6-BA3.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+LH2.0 g·L-1+AC1.0 g·L1 145~160 +++

表 2 不同培养基对素心建兰种子萌发的影响 Tab.2 Table 2 Effect of media on seed germination of C.ensifolium var.susin

将无菌萌发阶段获得的根状茎作为增殖培养材料，利用正交设计法[L9 (3³ )]研究了基本培养基、TDZ、NAA这3种因素对根状茎增殖的影响，从而优化增殖培养条件以筛选出适宜的培养基配方。增殖培养45 d后，采用称量法进行增殖情况统计，试验统计分析结果见表 3、表 4。

表 3(Tab.3)

表 3 L9(33)正交试验设计与极差分析结果Tab.3 Experimental design and results from orthogonal test L9(33) 处 理 因 素 根状茎平均增殖系数 A B C 1 MS 0.1 0.2 3.1 2 MS 0.5 0.5 3.9 3 MS 1.0 1.0 4.6 4 花宝1号 0.1 0.5 4.3 5 花宝1号 0.5 1.0 4.8 6 花宝1号 1.0 0.2 5.2 7 改良1号 0.1 1.0 5.8 8 改良1号 0.5 0.2 6.5 9 改良1号 1.0 0.5 7.3 k1 3.867 4.400 4.933 k2 4.767 5.067 5.167 k3 6.533 5.700 5.067 极差R 2.666 1.300 0.234 主次顺序 A>B>C 优水平 A3 B3 C2 优组合 A3 B3 C2

表 3 L9(33)正交试验设计与极差分析结果 Tab.3 Experimental design and results from orthogonal test L9(33)

表 4(Tab.4)

表 4 根状茎增殖系数方差分析结果Tab.4 Analysis of varianceon rhizome propagation rate 误差因素 SS df F F 0.05 显著性 F 0.10 显著性 A：基本培养基 11.042 2 262.905 19.000 * 9.000 * B：TDZ 2.536 2 60.381 19.000 * 9.000 * C：NAA 0.087 2 1.952 19.000 9.000

表 4 根状茎增殖系数方差分析结果 Tab.4 Analysis of varianceon rhizome propagation rate

表 3结果表明，从k值大小可以看出,在建兰根状茎增殖培养过程中,以改良1号为基本培养基较好，TDZ浓度需求量较高,适宜浓度为1.0 mg·L^-1，NAA适宜浓度为0.5 mg·L^-1；从极差R值大小可以看出，不同因素对根状茎增殖影响的主次关系为A>B>C，这说明对建兰根状茎增殖起主要作用是基本培养基，其次是TDZ，NAA对增殖的影响较小。根状茎增殖最佳处理组合是A₃ B₃ C²，即改良1号+TDZ 1.0 mg·L^-1 +NAA 0.5 mg·L^-1 + AC 0.5 g·L^-1+蔗糖30 g·L^-1，45 d平均增殖系数达7.3(图 1-C)。

从表 4可知，基本培养基和TDZ这2种因素均显著影响建兰根状茎增殖系数，但其影响程度的大小有较大差异，表现为基本培养基＞TDZ，NAA因素无显著影响，与极差分析结果一致。

根状茎在不同分化培养基中生长，芽分化效果不同(表 5)。处理1为不添加激素的培养基，根状茎不能分化出芽，而在处理2与处理3培养基中，根状茎均不同程度地分化出芽，以处理3分化效果最佳，芽分化率高，达86.3%，且芽体嫩绿，生长势强(图 1-D)，分化的芽均能成苗，成苗数达256个。表 5结果还表明，合适浓度的激素组合与配比，才可以促进根状茎芽的分化，处理2与处理3在相同基本培养基条件下，仅6-BA与NAA配比不同，而芽分化率差异较大，可见6-BA与NAA比值越大越有利于芽的分化。

表 5(Tab.5)

表 5 不同培养基对素心建兰根状茎分化的影响Tab.5 Effect of media on rhizome differentiation of C.ensifolium var.susin 处理 培养基 接种根状茎数/个 出芽根状茎数/个 芽分化率/% 成苗数/个 1 改良1号 + 白糖30 g·L-1 80 0 0 0 2 改良1号+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.1 mg·L-1+白糖30 g·L-1 80 69 86.3 256 3 改良1号+6-BA2.0 mg·L-1+NAA0.5 mg·L-1+白糖30 g·L-1 80 51 63.8 167

表 5 不同培养基对素心建兰根状茎分化的影响 Tab.5 Effect of media on rhizome differentiation of C.ensifolium var.susin

切取单芽接种到1/2MS+IBA 0.5 mg·L^-1+白糖 20 g·L^-1 +琼脂粉 6.0 g·L^-1+AC 0.5 g·L^-1壮苗生根培养基上，培养14 d左右开始发根，根呈放射状分布。壮苗生根培养60 d后，可形成健壮的完整植株(图 1-E)，生根率为100%。

当苗高5~6 cm，具4~5片叶时，将瓶苗放置温室炼苗21 d，以提高瓶苗适应力。出瓶后，生根苗置于1 000倍液百菌清杀菌剂溶液浸泡消毒5 min，捞出晾干，采用水苔包住根部植入4.5 cm育苗杯中。移栽3个月后，移栽成活率均在95%以上，且生长势较好(图 1-F)。

兰科植物通过种子无菌播种能够在短期内获得大量幼小植株，是现阶段经济有效的快速繁殖方法，也是工厂化育苗的重要途径之一^{[2, 4]}。但当前中国传统名兰还尚未真正实现工厂化生产，究其原因，其一组培技术快繁国兰，存在试管苗移栽后生长慢、试管苗可能变异等问题，其二根状茎增殖速度慢、芽分化率低等主要问题未得到突破，尤其是用茎尖诱导形成的根状茎初期的增殖速度更缓慢，这些严重阻碍了组培快繁技术在国兰种苗生产中的应用。

本试验筛选出素心建兰种子无菌萌发较适宜的培养基配方1/2MS+6-BA 3.0 mg·L^-1+NAA 0.5 mg·L^-1+LH 2.0 mg·L^-1+AC 1.0 g·L^-1，获得了根状茎无菌材料，为进一步快繁研究提供了无菌材料。研究中发现其在不同培养基中萌发耗时均较长,这可能与它的种皮致密、透性差,阻碍了水分的吸收和气体的交换,延滞了胚组织的发育，种胚的发育不全,储存的营养物质过少以及种子本身含有抑制种子萌发的物质有关。这与其他国兰的无菌萌发存在共性问题^{[5, 6]}。

孙安慈等^[9]、陈汉丽等^[10]、高丽等^[14]的报道表明，建兰基因型的差异对培养基的配方影响很大，探讨合适的培养基配方与培养条件是其实现快速繁殖的关键。本试验选择基本培养基、TDZ、NAA为关键试验因素，探索了素心建兰根状茎增殖培养技术。试验结果表明对根状茎增殖起主要作用的是基本培养基，其次是TDZ，NAA对增殖的影响较小；以改良1号为基本培养基较佳，TDZ适宜质量浓度为1.0 mg·L^-1，NAA适宜质量浓度为0.5 m g·L^-1，因此，筛选出根状茎较适宜的增殖培养基配方为改良1号 + TDZ 1.0 mg·L^-1+ NAA 0.5 mg·L^-1+白糖30 g·L^-1，45 d平均增殖系数可达7.3，繁殖率高。此外，通过不同培养基对根状茎分化培养的影响，筛选出适宜根状茎分化培养基配方为改良1号+6-BA2.0 mg·L^-1 +NAA 0.1 mg·L^-1+白糖30 g·L^-1，芽分化率达86.3%。本研究建立的根状茎增殖、分化培养技术，为素心建兰以种子→原球茎→根状茎→完整植株途径实现种苗的快速繁殖提供了技术基础。