甲热布错位于中国西藏自治区那曲地区尼玛县境内，湖区气候寒冷干燥，年均气温-2℃，能够在这样的环境下正常生长的微生物称为适冷微生物(Cold adapted microorganisims)。这种低温环境决定其中微生物功能的特殊性。研究表明，适冷微生物在分子水平上、能量与物质代谢机制、细胞膜结构、蛋白质合成机制等方面与常温微生物均有较大的差异^{[1, 2]}。从低温微生物中筛选新的生物活性物质已成为新的研究热点。低温微生物分泌的胞外酶在低温和中度温度下有较高的催化活性。蛋白酶是会水解蛋白质的一类酶的统称，广泛应用于食品、洗涤添加剂、饲料、造纸等行业，占世界用酶市场的60%以上。自20世纪70 年代以来，世界上已有许多实验室在从事低温蛋白酶的研究，已从海水、嗜冷的鱼类和贝类以及高山、南北极泥土、天山等样品中分离到产低温蛋白酶的菌株^{[3, 4]}，主要为假单胞菌Pseudomonas和黄单胞菌Xanthomonas等^{[4, 6]}，但关于产低温蛋白酶芽胞杆菌的文献报道甚少。本研究通过对西藏甲热布错湖边常年低温环境土壤中产低温蛋白酶的芽胞杆菌进行筛选、产酶特性分析，探讨其系统发育多样性，以期丰富对芽胞杆菌的认识，为低温蛋白酶生物技术的研发提供依据。

土壤样品：于2013年8月9日采集西藏自治区尼玛县甲热布错湖的湖边土壤(N87°58.464′，E32°21.273′)。NA培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、NaCl 5.0 g、水1 000 mL，pH7.2。蛋白酶筛选培养基：酵母提取物10.0 g、NaCl 5.0 g、胰蛋白胨5.0 g、干酪素 5.0 g、磷酸二氢钾 1.0 g、磷酸氢二钾 1.0 g、琼脂17 g、水1 000 mL，pH 7.2~7.4。

仪器： UVP GelDoc-It TS Imaging System凝胶成像仪(中国)、Biometra梯度PCR仪(美国)、BIO-RAD电泳仪(美国)、Eppendorf离心机(美国)。PCR反应试剂：10×Buffer，dNTP(10 mmol·L^-1/each)，Taq酶(2.5 U·μL^-1)(上海博尚生工生物工程技术服务有限公司)，100 bp Marker(上海英骏生物技术有限公司)。DNA提取试剂：100 mmol·L^-1 NaCl，10 mmol·L^-1 Tris/HCl，1 mmol·L^-1 EDTA，Tris-饱和酚。蛋白酶显色试剂：10% 三氯乙酸。

采用NA培养基将上述土壤样品在15℃培养1周后，挑选单菌落并种在酪蛋白平板上15℃培养3 d后，挑取有透明圈的菌落经划线分离后获得单菌落，采用-80℃甘油冷冻法保存。产蛋白酶菌株的初筛：采用点接法接种于蛋白酶初筛培养基，15℃ 培养3 ～ 5 d。加入适量的三氯乙酸染色10 min；最后挑选产透明圈的初筛菌株。不同培养温度蛋白酶活性的测定：菌株接种于液体NA培养基，4、15、25、35、45℃摇床培养72 h后，吸取10 μL菌液点接于蛋白酶筛选培养基上。不同pH蛋白酶活性的测定：菌株接种于pH5、6、7、8、9、10液体培养基，15℃培养72 h后，吸取10 μL菌液点接于蛋白酶筛选培养基上。培养3 d后，用游标卡尺测量水解圈直径和菌落直径大小。

采用常规酚氯仿法提取产低温蛋白酶菌株的基因组DNA。PCR扩增引物：采用细菌通用16S rRNA引物^[4]，引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反应体系(25 μL)：2.5 μL 10× Buffer、0.5 μL 10 mmol·L^-1 dNTP、引物各1 μL、0.3 μL(5 U·μL^-1)的Taq酶和1 μL DNA模板。PCR反应程序：94℃ 预变性5 min，94℃变性30 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸90 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。1.5%琼脂糖电泳检测出有条带的PCR产物送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序。

菌株的生理生化特性采用北京陆桥生物有限公司的微生物生化鉴定管进行检测。

根据所得到序列在网站EZtaxon-e.ezbiocloud.net上进行序列比对分析后^[7]，选择相关的参考菌株序列，再经Clustal X^[8]对齐后，用软件Mega 4.0^[9]进行聚类分析，构建聚类树^{[10, 11, 12]}。

从供试土壤中共分离纯化得到16株菌，经16S rRNA鉴定，其中芽胞杆菌有8株。根据产蛋白酶鉴别培养基上是否出现蛋白水解圈，从分离获得的8株芽胞杆菌中筛选得到1株产低温蛋白酶的菌株FJAT-24893(表 1)。

表 1(Tab.1)

表 1 天山1 号冰川底部沉积层产蛋白酶低温菌株的特征Tab.1 Characteristics of cold-adapted, protease-producingbacteria from Xizang 序号 菌株编号 最近匹配 中文名称 长度/bp 相似性/% 产酶 1 FJAT-24893 Bacillus frigoritolerans 耐寒芽胞杆菌 1397 99.86 + 2 FJAT-24895 Psychrobacillus psychrodurans 嗜冷芽胞杆菌 1406 99.50 - 3 FJAT-24896 Psychrobacillus psychrodurans 嗜冷芽胞杆菌 1401 99.57 - 4 FJAT-24897 Bacillus simplex 单纯芽胞杆菌 1408 99.93 - 5 FJAT-24904 Psychrobacillus psychrodurans 嗜冷芽胞杆菌 1397 99.71 - 6 FJAT-24907 Brevibacterium frigoritolerans 耐寒芽胞杆菌 1395 100.00 - 7 FJAT-24900 Paenibacillus amylolyticus 解淀粉类芽胞杆菌 1407 99.64 - 8 FJAT-24908 Paenibacillus odorifer 载味类芽胞杆菌 1408 98.04 - 9 FJAT-24898 Sporosarcina globispora 芽孢八叠球菌 1419 99.22 - 10 FJAT-24899 Sporosarcina psychrophila 芽孢八叠球菌 1402 98.57 - 11 FJAT-24901 Sporosarcina aquimarina 芽孢八叠球菌 1393 99.21 - 12 FJAT-24903 Sporosarcina globispora 芽孢八叠球菌 1395 99.21 + 13 FJAT-24905 Sporosarcina globispora 芽孢八叠球菌 1398 98.42 - 14 FJAT-24902 Rhodococcus qingshengji 红球菌 1368 100.00 - 15 FJAT-24894 Arthrobacter nitroguajaclicus 节杆菌 1382 99.80 - 16 FJAT-24906 Arthrobacter siccitolerans 节杆菌 1365 99.34 -

表 1 天山1 号冰川底部沉积层产蛋白酶低温菌株的特征 Tab.1 Characteristics of cold-adapted, protease-producingbacteria from Xizang

构建土壤样品分离获得的产低温蛋白酶菌株的系统发育树(图 1)。由系统发育树可知，该产蛋白酶菌株隶属于芽胞杆菌属(Bacillus)。FJAT-24893与参考菌株Bacillus frigoritolerans DSM8801^T的16S rRNA序列相似性为99.9%，产低温蛋白酶菌株FJAT-24893与耐寒芽孢杆菌的亲缘关系很近，位于同一分支。故该菌株初步鉴定为耐寒芽胞杆菌Bacillus frigoritolerans。

图 1(Fig. 1)

图 1 基于部分16S rRNA基因序列的产低温蛋白酶低温菌株系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree of protease-producing strain based on 16S rRNA gene sequences

不同温度条件下菌株FJAT-24893产低温蛋白酶活性试验结果表明(表 2)，该菌株在25℃时产蛋白酶水解圈最大，水解圈与菌圈的比值最大，达3.47。最适产酶条件为25℃。

表 2(Tab.2)

表 2 不同温度FJAT-24893菌株蛋白酶水解透明圈与菌落直径的大小及比值Tab.2 Size and ratio on colony diameter of enzymatic hydrolysis area produced by FJAT-24893 at different temperatures 项目 4℃ 15℃ 25℃ 35℃ 45℃ 透明圈/mm 0.00 23.61 30.08 14.13 14.13 菌圈/mm 5.89 7.35 8.68 7.45 7.45 比值 0.00 3.21 3.47 1.90 1.90

表 2 不同温度FJAT-24893菌株蛋白酶水解透明圈与菌落直径的大小及比值 Tab.2 Size and ratio on colony diameter of enzymatic hydrolysis area produced by FJAT-24893 at different temperatures

不同pH条件下菌株FJAT-24893产蛋白酶活性结果表明(表 3)，FJAT-24893在pH为8时蛋白酶水解圈与菌圈的比值最大，最适产酶pH为8。

表 3(Tab.3)

表 3 不同pH值FJAT-24893菌株蛋白酶水解透明圈与菌落的大小及比值Tab.3 Size and ratio on colony diameter of enzymatic hydrolysis area produced by FJAT-24893 at different pH values 项目 pH5 pH6 pH7 pH8 pH9 pH10 透明圈/mm 18.69 18.16 17.25 18.27 18.04 16.10 菌落直径/mm 5.10 5.12 5.10 5.10 5.11 5.08 比值 3.66 3.55 3.38 3.58 3.53 3.15

表 3 不同pH值FJAT-24893菌株蛋白酶水解透明圈与菌落的大小及比值 Tab.3 Size and ratio on colony diameter of enzymatic hydrolysis area produced by FJAT-24893 at different pH values

表 4为细菌常规生理生化试验结果，结果表明产低温蛋白酶菌株Bacillus frigoritolerans FJAT-24893细胞具有运动性，鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶反应为阳性，明胶液化、硝酸还原和V-P反应为阴性，不能利用西蒙氏柠檬酸盐、肌醇等碳源产酸。

表 4(Tab.4)

表 4 产低温蛋白酶菌株Bacillus frigoritolerans FJAT-24893的生理生化特征Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of FJAT-24893 特征 结果 运动性 + 明胶液化 - 硝酸还原 - 脲酶 - 鸟氨酸脱羧酶 + 赖氨酸脱羧酶 + H2S - 丙二酸盐 - 西蒙氏柠檬酸盐 - 肌醇 - 甘露醇 - 蜜二糖 - 山梨糖 - V-P -

表 4 产低温蛋白酶菌株Bacillus frigoritolerans FJAT-24893的生理生化特征 Tab.4 Physiological and biochemical characteristics of FJAT-24893

目前，关于产低温蛋白酶芽胞杆菌的分离相关报道仍较少。史劲松等^[13]从中国冰川1号样品获得1株产适冷蛋白酶的蜡状芽胞杆菌，万琦等^[14]获得1株产低温碱性蛋白酶的枯草芽胞杆菌，高兆建等^[15]报道了短短芽胞杆菌产低温弹性蛋白酶。目前，尚未发现产低温蛋白酶菌株的耐寒芽胞杆菌。本文从西藏样本中分离获得1株产低温蛋白酶菌株FJAT-24893，并鉴定为耐寒芽胞杆菌(Bacillus frigoritolerans)。根据对嗜冷菌(Psychrophile)和耐冷菌(Psychrotrophs)的定义，FJAT-24893能够在5~10℃下缓慢生长，15~20℃下快速生长，并大量合成胞外蛋白酶，表明它是1株来源于陆地高寒生态环境下的产蛋白酶耐冷菌。

耐寒芽胞杆菌广泛分布在土壤中，但关于该菌的功能的研究仍处于起步阶段。Jariyal等^[16]筛选到1株降解农田土壤中甲拌磷的菌株B.frigoritolerans Imbl 2.1。本研究中的耐寒芽胞杆菌FJAT-24893在10~45℃、pH5~10时均具有较高蛋白酶活性，这就为其在室温、pH 为中性条件下工业生产应用提供了可能。而关于耐寒芽胞杆菌FJAT-24893分泌低温蛋白酶的分离纯化、酶学特性、适冷机制等有待进一步研究。