白补药Salvia scapiformis Hance var. Hirsute Stib为唇形科Lamiaceae多年生草本植物花径状丹参的全草，又名地埂鼠尾草、翻天雷公^[1]。研究发现唇形科植物的化学成分主要有挥发油、二萜醌类、生物碱类、黄酮类、昆虫变态激素等^{[2, 3]}。其中，黄酮类化合物具有延缓衰老、增强心血管功能、调节内分泌系统、抗肿瘤、抗过敏、抗病毒、抗辐射等作用^{[4, 5]}，在医药、食品、化妆品工业上，受到人们的广泛关注^[6]。

目前对白补药仅见有关成分的研究^[3]，对白补药中总黄酮提取及含量的测定未见报道。贵州省的雷公山是我国中亚热带的一个极为珍贵的物种基因库，是贵州省中药材的主产区之一^[7]。为寻找新的黄酮药源，以雷公山丰富的白补药为考察对象，分别通过微波、超声波、乙醇回流等提取方法提取白补药中总黄酮^{[8, 9, 10, 11]}，采用NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色，在506 nm处，以紫外分光光度法测定总黄酮含量^[12]，筛选出白补药总黄酮提取量高的方法，并对该提取方法进行优化，为进一步系统的开发利用雷公山白补药提供理论参考。

仪器：紫外-可见光谱分析仪(UV-2550型，日本岛津公司)；电子分析天平(FA1004、长沙市秋龙仪器设备有限公司)；循环式真空泵[SHZ-D(III)，巩义市科瑞仪器有限公司]；万能高速粉碎机(北京永兴仪器有限公司)；MAS-Ⅱ常压微波合成仪(上海新仪微波化学科技有限公司)；WH-300超声清洗机(济宁万和电子设备有限公司)。

试剂：芦丁(国药集团化学试剂有限公司)；无水乙醇、亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝均为分析纯。

材料：白补药2014年6月采于贵州雷公山，野生。样品经洗净、晒干、粉碎后过40目筛，备用。

最大吸收波长选择：吸取0.25 mL芦丁标准溶液和1.2.2黄酮提取液0.25 mL于4个 10 mL 容量瓶中，各加40%乙醇溶液至4mL，依次加入0.5 mL 5% NaNO₂，摇匀，静置6 min，再加入0.5 mL 10% Al(NO₃)₃ ，摇匀，静置6 min，继续加入4 mL 4% NaOH，用40%乙醇定容至10 mL，摇匀，静置10～20 min，在200～700 nm进行光谱扫描。在506 nm处均有最大吸收，故以506 nm为黄酮测定波长。

标准曲线绘制：准确称取25.90 mg干燥至恒重的芦丁用少量40%乙醇溶解并转移至100 mL容量瓶中，用40%乙醇定容至刻度，摇匀，配得质量浓度为0.259 mg·mL^-1的芦丁标准溶液。分别吸取0.0、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mL芦丁标准液至6个10 mL容量瓶中，加入显色剂，在506 nm波长处测定吸光度。以芦丁质量浓度x(mg·mL^-1)为横坐标，芦丁吸光度y为纵坐标，绘制芦丁标准曲线。

平行精确称取1 g白补药粉末3份，分别置于3个250 mL圆底烧瓶中，加入40%乙醇溶液30 mL浸泡30 min，3份样品分别采用回流(1 h)、微波及超声(温度50℃，功率300 W，时间3 min)等方法提取，然后分别过滤，用40% 的乙醇补足体积至30 mL，得白补药总黄酮回流、微波、超声提取液。每种提取方法均重复进行3次。提取液各取0.25 mL，在波长506 nm测定吸光度。根据以下公式计算总黄酮提取率：

式中：C表示样品液所测吸光度对应于标准曲线上的质量浓度(mg·mL^-1)；V表示样品提取液体积(mL)；n表示提取液稀释倍数，m表示白补药样品质量(g)。

精确称取1 g白补药粉末于250 mL圆底烧瓶中，根据1.2.2试验结果，对提取率高的提取方法进行单因素实验，分别考察不同的乙醇浓度、料液比、时间、功率、提取次数对总黄酮提取率的影响。取提取液0.25 mL，在波长506 nm测定吸光度。重复3次。

精密度实验：精确称量1 g白补药粉末于圆底烧瓶中，按最佳条件提取总黄酮，取提取液0.25 mL，在波长506 nm测定吸光度，重复测定5次吸光度，计算白补药中总黄酮提取率和RSD。

稳定性实验：精确移取芦丁对照液0.25 mL，在波长506 nm测定吸光度，每隔10 min测定1次吸光度，共测10次，计算RSD。

回收率实验：精确称取同一批白补药1 g，按最佳条件提取总黄酮，分别精密加入芦丁对照品，取提取液0.25 mL，在波长506 nm测定吸光度，计算平均回收率和RSD。

精确称取白补药粉末1 g(平行5份)于5个250 mL 圆底烧瓶中，根据最佳工艺提取总黄酮，取提取液0.25 mL，在波长506 nm测定吸光度，计算总黄酮的提取率和含量。

采用SPSS19.0软件设计因素水平表，并对正交试验进行方差分析。

将1.2.1试验结果进行线性回归，回归方程为y=11.125x+0.0047，R=0.9997。芦丁浓度在0.0155～0.0570 mg·mL^-1范围内线性关系良好。

采用回流、微波、超声等方法提取白补药中总黄酮，结果见图 1。微波提取法总黄酮得率最高为6.17%，其次为超声提取法5.37%，回流提取法最低4.62%。微波提取得率较高，且与回流提取和超声提取之间总黄酮提取率存在显著差异(P＜0.05)。以上结果表明，微波提取白补药中总黄酮具有省时、高效、提取率高的优点，为此进一步优化微波提取条件。

图 1(Fig.1)

图 1 不同提取方法对总黄酮含量的影响 Fig.1 Effect of extraction methods on content of total flavonoids

1∶10的料液比、50%乙醇、30℃温度浸泡白补药粉末2 min，分别以功率为变量(300、400、500、600、700、800 W)，微波提取1 min，抽滤得提取液。取0.25 mL，测定吸光度。重复3次，结果如图 2所示。

图 2(Fig.2)

图 2 微波功率对总黄酮含量的影响 Fig.2 Effect of microwave power on content of total flavonoids

由图 2可见，微波功率从300 W增至400 W时总黄酮提取率增至最大，之后随着功率增大提取率减小。微波功率增大会增加细胞的破碎程度，增加总黄酮溶出量，提取率增大；随着微波功率增大至一定临界点，可能会破坏黄酮类化合物，同时可能使更多脂溶性物质溶出，导致总黄酮得率减小^[13]。差异分析表明，采用400 W的功率与300、500、600、700 W功率相比较，总黄酮提取率之间存在显著差异(P＜0.05)，故选择最佳提取功率400 W。

400 W功率，30℃温度、1∶10的料液比、50%乙醇浸泡白补药2 min，以微波时间为变量(1、1.5、2、2.5、3 min)提取、抽滤得提取液，取0.25 mL，测定吸光度。重复3次，试验结果如图 3所示。

图 3(Fig.3)

图 3 提取时间对总黄酮含量的影响 Fig.3 Effect of extraction time on content of total flavonoids

由图 3可知，在1～2.5 min内，随着时间的增加，分子剧烈运动，致使植物细胞破碎，有效成分溶出，总黄酮提取率增加^[14]。2.5 min时总黄酮提取率达到最大为8.45%，大于2.5 min提取率降低。同时差异分析表明，微波提取白补药中总黄酮2.5 min与1、1.5、2、3 min相比较，提取率之间存在显著差异(P＜0.05)，故提取时间2.5 min 为最佳。

400 W功率、 30℃温度、50%乙醇，分别以料液比(g.mL^-1)为变量(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)浸泡白补药2 min，微波提取1 min，抽滤得提取液，取0.25 mL，测定吸光度。重复3次，结果如图 4所示。

图 4(Fig.4)

图 4 料液比对总黄酮含量的影响 Fig.4 Effect of material-liquid ratio on content of total flavonoids

由图 4可知，料液比在1∶10～1∶30范围内，随着料液比的增大，溶剂的渗透作用增强，有利于黄酮的溶解及扩散，总黄酮的提取率增加，料液比为1∶30时，提取率达到最高值8.08%。料液比在1∶30～1∶50时，因为提取液体积增大后，升温速度变慢，导致1 min内微波提取率降低。另外差异分析表明，采用1∶30的与1∶10、1∶20、1∶40、1∶50的相比较，总黄酮提取率之间存在显著差异(P＜0.05)，故选择最适料液比为1∶30。

400 W功率、30℃温度，1:30的料液比，以乙醇含量为变量(30%、40%、50%、60%、70%)分别浸泡白补药2 min，微波提取1 min，抽滤得提取液，取0.25 mL，测定吸光度。重复3次，试验结果如图 5所示。

图 5(Fig.5)

图 5 乙醇浓度对总黄酮含量的影响 Fig.5 Effect of ethanol concentration on content of total flavonoids

图 5结果表明，乙醇质量分数在30%～40%范围内，总黄酮提取率增大，40%时提取率达到最大值为8.06%。随着乙醇质量分数增加，提取率减小。这是因为总黄酮含黄酮苷及黄酮苷元，黄酮苷易溶于水，黄酮苷元难溶于水^[15]，故采用不同极性溶剂提取，总黄酮得率不同，40%乙醇对黄酮苷元和黄酮苷的溶解性较好，随着乙醇质量分数增加，溶剂极性减小，黄酮苷溶解性减小，总黄酮得率减小。同时通过差异分析表明，采用40%乙醇与30%、50%、60%、70%乙醇作溶剂相比较，总黄酮提取率之间存在显著差异(P＜0.05)，故选择乙醇质量分数为40%。

400 W功率、30℃温度、1∶30的料液比、40%乙醇浸泡白补药2 min，分别采取不同提取次数1、2、3、4次，微波提取1 min，抽滤得提取液，取0.25 mL，测定吸光度。重复3次，试验结果如图 6所示。

图 6(Fig.6)

图 6 提取次数对总黄酮含量的影响 Fig.6 Effect of number of extraction on content of total flavonoids

由图 6可见，提取次数对总黄酮含量的影响明显，提取次数由1次增加至2次时,总黄酮提取率增大，且差异分析表明提取1次和提取2次所得总黄酮的提取率之间存在显著性差异(P＜0.05)。然而当提取次数由2次增大到4次时，总黄酮提取率不存在显著性差异(P＞0.05)。分析认为，采用微波提取白补药中的总黄酮的最佳提取次数为2次。

根据单因素结果，设计4因素3水平对白补药总黄酮提取率影响的正交试验L₉ (3⁴)(表 1)。 采用SPSS 19.0软件系统，对正交试验结果进行方差分析，结果见表 2(R²=0.964)。选取检验的显著性水平为α=0.05，由表 2数据可看出，时间、料液比、功率、乙醇含量4个因素的检验P值均小于0.05，表明时间、料液比、功率、乙醇含量对白补药总黄酮提取率有显著影响，而且时间、料液比、功率、乙醇含量4个因素的自由度相等(df=2)，故用F值来判断影响效果。由此影响白补药总黄酮提取率的主次因素为时间＞乙醇浓度＞功率＞料液比。4个因素对白补药总黄酮提取率存在极显著的差异(P=0.000＜0.05)。选用S-N-K法作均数间多重两两比较，结果见表 3，表明微波提取白补药中总黄酮的最佳条件为：时间2 min、料液比1∶40、功率400 W、乙醇质量分数50%。

表 1(Table 1)

表 1 正交试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test 水平 因素 时间/min 料液比 功率/W 乙醇质量分数/% 1 2 1∶20 300 30 2 2.5 1∶30 400 40 3 3 1∶40 500 50

表 1 正交试验的因素与水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表 2(Table 2)

表 2 正交试验结果方差分析Table 2 Variance analysis on orthogonal test results 方差来源 III 型平方和 自由度 均方 F值 P值 校正模型 28.615 9 3.179 51.938 0.000 截距 892.630 1 892.630 14581.629 0.000 时间 18.959 2 9.479 154.850 0.000 料液比 0.755 2 0.378 6.168 0.024 功率 4.072 2 2.036 33.262 0.000 乙醇含量 4.768 2 2.384 38.945 0.000 重复组 0.061 1 0.061 0.991 0.349 误差 0.490 8 0.061 总计 921.735 18 校正的总计 29.105 17

表 2 正交试验结果方差分析 Table 2 Variance analysis on orthogonal test results

表 3(Table 3)

表 3 S-N-K分析结果Table 3 Results of S-N-K analysis (α=0.05) 因素 N 子集 1 2 3 时间/min 3 6 6.0670 2.5 6 6.595 2 6 8.4613 sig. 1.000 1.000 1.000 料液比/(g·mL -1) 1∶20 6 6.868 1∶30 6 6.928 1∶40 6 7.330 sig. 0.686 1.000 功率/W 300 6 6.673 500 6 6.736 400 6 7.714 sig. 0.686 1.000 乙醇含量/% 40 6 6.657 30 6 6.700 50 6 7.770 sig. 0.771 1.000

表 3 S-N-K分析结果 Table 3 Results of S-N-K analysis

精密度试验结果相对标准偏差RSD为0.68%，表明该方法精密度良好。

NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色后的5～30 min内吸光度变化不大，RSD为0.16%，说明显色后30 min内稳定性好。加标回收率为98.01%，RSD为1.42%，表明该方法可靠性好。

根据最佳工艺提取白补药总黄酮，总黄酮的提取率和含量测定结果见表 4。表明用最佳工艺条件提取白补药中总黄酮的提取率为9.28%，高于其他各正交试验值，故最佳工艺条件可靠、稳定。首次测得雷公山白补药中总黄酮含量为92.58 mg·g^-1。

表 4(Table 4)

表 4 最佳工艺的验证试验结果Table 4 Verification test on optimized process 序号 取样量/g 总黄酮提取率/% 总黄酮提取率平均值/% 总黄酮含量/(mg·g-1) 总黄酮平均含量/(mg·g-1) 1 1.0028 9.26 92.62 2 1.0018 9.32 9.28 93.21 92.58 3 1.0025 9.17 91.73 4 1.0015 9.53 95.33 5 1.0035 9.15 91.52

表 4 最佳工艺的验证试验结果 Table 4 Verification test on optimized process

以白补药为原料、乙醇为溶剂，对比回流、微波、超声3种提取方法对黄酮的提取。试验结果表示，微波提取法相比于超声和回流具有操作简便、成本低、无污染，提取率高、速度快等优点。本试验通过L₉ (3⁴)正交试验对微波提取法的乙醇浓度、提取时间、料液比、微波功率进行了优化。结果表示提取时间为2 min、料液比为1∶40、功率为400 W、乙醇质量分数为50%，间歇提取2次为最佳提取条件。在最佳的微波提取条件下，采用紫外分光光度法、NaNO₂-Al(NO₃)₃-NaOH显色体系，测定了雷公山白补药总黄酮含量为92.58 mg·g^-1，含量高于唇形科药用植物黄芩^[13](18.34 mg·g^-1)、夏枯草^[14](50.50 mg·g^-1)、紫苏^[15](40.14 mg·g^-1)、薄荷^[16](21.60 mg·g^-1)。并对该方法的精密度、稳定性、回收率进行了研究，结果表明，该方法具有良好的准确度、稳定性以及可靠性。本研究为开发贵州雷公山丰富的白补药资源提供了理论参考。