中国明对虾Fenneropenaeus chinensis 又称“中国对虾”，是中国沿海重要的海水养殖种类，具有较高的经济价值。在对虾的生活史中，要经过大约50次的蜕壳,若不能顺利蜕壳，将直接导致对虾生长滞缓，甚至死亡。经证实，对虾的周期性蜕皮与N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52，以下简称NAGase)和几丁质酶(EC3.2.1.14)的生理过程密切相关^[1]。NAGase是几丁质酶系中的一种^[2]，主要分布在甲壳动物的体壁与内脏,目前已在多种甲壳动物如在凡纳滨对虾Penaeus vannamei^[3]、日本沼虾Macrobrachium nipponense^[4]、中华绒螯蟹Eriocheir sinensis^[5]、锯缘青蟹Scylla serrata^[6]等体内分离到NAGase。

近年来，随着沿海地区经济社会的发展和陆源污染物的增加，海水养殖环境急剧变化，水体中的有机化合物出现严重超标的现象,这必将影响对虾NAGase的活力及构象，进而扰乱对虾正常的生理活动与物质代谢,导致对虾的大量死亡^[7]。目前，有机溶剂对甲壳动物内脏NAGase的影响研究相对较多，而对体壁NAGase影响的报道则较少。本课题组此前已从中国明对虾体壁中分离纯化出NAGase^[8]，现进一步研究分析6种醇类物质、二甲亚砜、二氧六环、甲醛和丙酮对中国明对虾体壁NAGase活力的影响，判断甲醛和丙酮对NAGase的作用机理，为进一步探讨养殖环境污染与对虾的生长发育的相关性提供科学的理论依据。

NAGase：由本课题组从中国明对虾体壁分离纯化得到，方法参考文献^[8]，获得的酶制剂为PAGE单一纯,比活力为3 938.56 U·mg ^-1；对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷：上海医药工业研究院生化室; 10种有机溶剂甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙二醇、丙三醇、二甲亚砜、二氧六环、甲醛、丙酮以及其他试剂为国产分析纯。

NAGase活力的测定参照文献^[9]，以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷为底物，在2.0 mL的酶活力测定体系中，将1 mL 0.075 mol·L^-1 NaAc-HAc缓冲液(pH5.2)，0.2 mL 5 mmol·L^-1的底物，0.78 mL蒸馏水置于37℃恒温水浴中加热10 min，接着加入20 μL酶液，反应10 min后加入2 mL 0.5 mol·L^-1 NaOH终止反应，最后在752型Spectrum紫外可见分光光度计上测定波长为405 nm的光密度值(OD_{405 nm})，消光系数按1.73×10⁴ mol·L^-1·cm ^-1计算^[3]。

以甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙二醇、丙三醇、二甲亚砜、二氧六环、甲醛、丙酮为效应物，在测活体系中加入不同体积分数的有机溶剂(表1)，以不加有机溶剂为空白对照，检测酶的剩余活力，以酶的相对活力(%)表示，并将酶的相对活力下降50%时的有机溶剂体积分数定为半抑制剂量IC₅₀。

表1(Tab. 1)

表1 10种有机溶剂体积分数水平Tab. 1 Concentrations of 10 organic solvents applied for testing 有机溶剂 水平设置/%(体积分数) 甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙二醇、丙三醇、二甲亚砜、二氧六环 0.5、1、2.5、5、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、55 甲醛 1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22 丙酮 0.5、1、3、4、5、6、7.5、10、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50

表1 10种有机溶剂体积分数水平 Tab. 1 Concentrations of 10 organic solvents applied for testing

在测活体系中，固定底物浓度为5 mmol·L^-1，在0%、3%、4%、5%、6% 5个不同甲醛体积分数下，改变加入的酶量，测定各自的酶活力，分析在不同甲醛体积分数下酶量与酶活力大小的关系，判断甲醛对NAGase的抑制作用机理。

在测活体系中，固定底物浓度为5 mmol·L^-1，在0%、0.5%、1%、2%、3% 5个不同丙酮体积分数下，改变加入的酶量，测定各自的酶活力，判断丙酮对NAGase的激活作用机理。进一步研究在10%、15%、20%、25%、30% 5个不同丙酮体积分数下，改变加入的酶量，测定各自的酶活力，判断丙酮对NAGase的抑制作用机理。

从图1和图2可见，6种醇类物质对中国明对虾体壁NAGase活力的影响程度不同，除了正丁醇对酶表现为激活作用外，其余醇类物质对酶都表现出先激活后抑制的趋势，即当体积分数较低时表现出激活作用，随着醇类体积分数的增大激活作用减弱并迅速转为抑制作用。

图1(Fig.1)

图1 甲醇(a)、乙醇(b)、正丙醇(c)和正丁醇(d)对NAGase活力的影响 Fig.1 Effects of methanol (a),alcohol (b),propanol (c),and butanol (d) on NAGase activity

图2(Fig.2)

图2 乙二醇(a)、丙三醇(b)对NAGase活力的影响 Fig.2 Effects of glycol (a),and glycerol (b) on NAGase activity

从图1可知，4种伯醇对体壁NAGase的激活能力强弱依次为甲醇>乙醇>正丙醇>正丁醇，当它们的体积分数都为5%时，依次使酶活力提高了219.79%、174.95%、123.75%和88.21%；当甲醇、乙醇和正丙醇的体积分数高达55%时，均能使酶活力丧失95%以上，而55%正丁醇可使酶活力提高5.32%。

从图2可知，乙二醇对体壁NAGase的激活作用强于丙三醇，当乙二醇和丙三醇体积分数为5%时，可分别使酶活力提高了192.12%、65.56%；而当它们的体积分数高达55%时，分别导致酶活力丧失85.45%和9.94%。

随着二甲亚砜浓度的增加，体壁NAGase活力表现出先激活后抑制的趋势(图3)。二甲亚砜对NAGase的最大激活作用可使其活性提高22.97%；而当二甲亚砜体积分数达到55%时，酶活力几乎丧失，对酶活力抑制的IC₅₀为12.5%。

图3(Fig.3)

图3 二甲亚砜对NAGase活力的影响 Fig.3 Effect of dimethyl sulfoxide on NAGase activity

从图4可知，二氧六环对体壁NAGase活力的影响，与二甲亚砜对NAGase的影响趋势相似，当二氧六环体积分数为2.5%，可使NAGase活性提高13.69%；当二氧六环体积分数达到45%时，酶活力完全丧失。

图4(Fig.4)

图4 二氧六环对体壁NAGase活力的影响 Fig.4 Effect of dioxane on NAGase activity

从图5可知，甲醛对体壁NAGase活力的影响呈现明显的浓度效应，随着甲醛体积分数的不断升高，对NAGase的抑制作用逐渐增强，当甲醛体积分数达到22%时，酶活力丧失96.58%，对酶活力抑制的IC₅₀为6%。

图5(Fig.5)

图5 甲醛对NAGase活力的影响 Fig.5 Effect of formaldehyde on NAGase activity

从图6可知，在不同甲醛浓度下，体壁NAGase活力与酶量的关系通过作图，可得到一组通过原点不同斜率的直线，随着甲醛体积分数的升高，直线的斜率不断降低。说明甲醛对酶的抑制作用是一个可逆过程。

图6(Fig.6)

图6 甲醛对NAGase的抑制机理判断 Fig.6 Determination of inhibitory mechanism of formaldehyde on NAGase 注：1~5的甲醛体积分数分别为0%、3%、4%、5%、6%。

从图7可知，丙酮对体壁NAGase活力的影响表现出先激活后抑制的趋势，当丙酮体积分数小于18%时，它对酶均表现为激活作用，在6%的体积分数下可使NAGase活性提高84.38%。当丙酮体积分数高于18 %时，随着体积分数的逐渐升高，NAGase活力不断下降。当丙酮体积分数达到50%时，可使酶活力丧失92.71%。

图7(Fig.7)

图7 丙酮对NAGase酶活力的影响 Fig.7 Effect of acetone on NAGase activity

从图8可知，当丙酮体积分数低于18%时，在不同丙酮体积分数下，体壁NAGase活力与酶量的关系通过作图，可得到一组通过原点的不同直线，随着丙酮体积分数的升高，直线的斜率先增大后下降，且直线斜率均大于丙酮体积分数为0%时的直线斜率，说明在0~18%丙酮体积分数范围内，丙酮对NAGase活力的激活表现为可逆的激活作用。

图8(Fig.8)

图8 丙酮对NAGase激活与抑制的机理的判断 Fig.8 Determination of activating and inhibitory mechanisms of acetone on NAGase 注：直线1~10分别表示丙酮体积分数为0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、10.0%、15.0%、20.0%、25.0%、30.0%。

当丙酮体积分数高于18%时，在不同丙酮体积分数下，体壁NAGase活力与酶量的关系通过作图，也得到一组通过原点的直线，直线斜率随丙酮体积分数增大而降低，说明当体积分数大于18%时，丙酮对酶活力的抑制则表现为可逆抑制作用。

NAGase构象主要是依靠酶分子中的次级键来维持，而有机溶剂往往会改变反应体系的疏水性，进而通过影响酶分子的构象来改变酶的活性。有研究表明甲醇、乙醇、正丙醇、乙二醇、丙三醇对南美白对虾Penaeus vannamei体壁几丁质酶有抑制作用^[10]，而在本试验中，5种醇类物质对中国明对虾体壁NAGase均表现出先扬后抑的作用趋势。可能是由于在低浓度下，维持蛋白质分子构象的次级键发生变化，增强酶活性中心的“柔性”。但随着有机溶剂体积分数的升高，它们对酶的抑制作用增强，其原因可能是一方面蛋白质失活的趋势增加，另一方面酶的“柔性”因为含水量的下降而减小，导致酶抵抗失活的能力减弱^[11]。

本试验还发现，正丁醇在0～55%体积分数下对NAGase均表现为激活作用，这与南美白对虾内脏NAGase在7.5%体积分数下已使酶活力下降56%的现象不同^[12]，可能是因为正丁醇分子或其中的某个基团与体壁NAGase分子共价结合，使酶的空间构象发生改变，更有利于活性中心与底物结合，并形成准确的催化部位，从而提高酶活力。

二甲亚砜和二氧六环都是强极性溶剂,二甲亚砜溶液对太平洋白对虾Penaeus vannamei NAGase^[13]和锯缘青蟹NAGase^[6]均有明显的失活作用；此外，二甲亚砜对杂色鲍Haliotis diversicolor碱性磷酸酶也有明显的失活作用，其分子构象变化主要表现在酶分子的主肽链以紧密的构象变成松散状态、从有序的二级结构变成无规线团^[14]。本试验结果表明，二甲亚砜溶液对中国明对虾体壁NAGase表现为体积分数小于7.5%时具有激活作用，随着二甲亚砜浓度增大对酶转为失活作用的趋势。

黄小红等^[15]研究表明低浓度二氧六环对苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis几丁质酶的影响不明显,浓度高于5%时对酶则有激活作用; 但二氧六环对鸡肝酯酶主要表现为失活作用^[16]。而南美白对虾体壁几丁质酶在二氧六环溶液中，表现出低浓度激活高浓度抑制的效应^[10]，这与本试验结果相似，当二氧六环体积分数小于7.5%时，对中国明对虾体壁NAGase有激活作用，随着二氧六环体积分数增大，对NAGase的抑制作用不断增强。

醛类化合物中醛基能与酶蛋白中的羟基、巯基、羧基起作用，它们经常出现在酶的活性中心，其性质改变会导致酶变性失活^[15]。研究表明，甲醛对南美白对虾^[17]、锯缘青蟹^[18]、中华绒螯蟹^[5]的内脏NAGase的失活作用均表现出浓度效应，且它们的失活过程均显示为可逆，这与本试验结果相似，说明甲醛与中国明对虾体壁NAGase是以非共价键结合，通过抑制酶活力而导致催化效率的降低。

丙酮是一种极性溶剂，它对锯缘青蟹内脏NAGase的失活作用表现出浓度效应，且这种失活作用是一个可逆过程^[19]；而丙酮对南美白对虾体壁的几丁质酶有一定的激活作用，随着浓度的升高，激活作用增强，而后激活作用渐趋平稳^[10]。在本试验中，当丙酮体积分数小于18%时，丙酮对中国明对虾体壁NAGase激活作用呈现先上升后下降的趋势，通过酶活力与酶量的关系图判断其为可逆激活，这与王悦等^[7]研究的乙醇对南美白对虾NAGase的激活机理相似，其原因可能是丙酮与NAGase之间的结合是非共价的，低浓度的丙酮只是通过影响酶结合基团和催化基团的解离状态从而影响酶对底物的催化，致使反应加速进行；而当体积分数大于18%时，可能由于丙酮分子会介入酶分子的内部，改变了酶微环境的极性，从而降低酶的催化活性^[20]，导致对酶的抑制作用。

综上所述，不同有机溶剂对中国明对虾体壁NAGase活力的影响不同，NAGase在不同浓度有机溶剂中的催化作用存在差异性。当养殖环境受到污染时，有机溶剂将通过影响对虾体壁NAGase活性间接影响对虾的生长发育。因此，适时监控水体中有机溶剂的变化，对促进对虾的健康养殖具有重要的意义。