2016, Vol. 31
嗜碱菌是指最适生长在pH 8.0以上，通常在pH 9.0~10.0之间的一类微生物。嗜碱菌具有极为特殊的生理结构和代谢机制，能产生具有特殊性质的生物活性物质，它们产生的胞外酶多为碱性酶，在洗涤剂、制革、纺织、医药、化妆品等的生产中有广泛的应用价值[1, 2, 3]。近年来嗜碱菌研究受到广泛关注。
芽胞杆菌广泛存在于自然界中，具有丰富的生理生化多样性。嗜碱芽胞杆菌类群rRNA group 6 是一类嗜碱、产芽孢的类群[4]，由15种芽胞杆菌B.agaradhaerens，B.alcalophilus，B.algicola，B.arseniciselenatis，B.clarkii，B.cohnii，B.halodurans，B.horti，B.krulwichiae，B.okuhidensis，B.pseudalcalophilus，B.pseudofirmus，B.selenitireducens，B.thermocloacae 和 B.vedderi组成[5]。嗜碱芽胞杆菌类群研究相对于其他特性种类起步较晚，这类微生物能产生多种酶资源，如碱性蛋白酶[6]、淀粉酶[7]、纤维素酶[8]、几丁质酶[9]等，在生物农药[10]、环境修复和污染治理[11]上发挥着重要作用。本研究调查西藏尼玛县盐碱地环境嗜碱芽胞杆菌资源，旨在获得特殊功能的嗜盐碱芽胞杆菌，丰富我国芽胞杆菌种类，为后期特殊功能研究以及开发特殊产品提供资源。
1 材料与方法 1.1 试验材料样品采集：2013年8月采集于西藏尼玛县戈芒甲亚乡盐碱地环境土壤(纬度87°48.951′，经度31°11.692′)，取0~20 cm深度的土壤样品装入无菌自封袋。样品采集后带回实验室于4℃保存。
NA培养基：蛋白胨10.0 g、牛肉浸膏3.0 g、NaCl 50.0 g、水1 000 mL，pH9.0。
1.2 仪器与试剂 1.2.1 仪器振荡器、培养箱、VP GelDoc-It TS Imaging System凝胶成像仪、华粤行仪器有限公司Tpersonal Biometra梯度PCR仪、PowerPac Basic BIO-RAD电泳仪、离心机(Eppendorf Centrifuge 5418R)。
1.2.2 试剂2×Power TaqPCR Master Mix(Bioteke Corporation)，10 mmol·L-1Tris/HCl(购自上海博尚生工生物工程技术服务有限公司)，Tris饱和酚(购自上海博尚生工生物工程技术服务有限公司)，100 bp Marker(上海英骏生物技术有限公司)；商业生化鉴定试剂管购买自北京陆桥生物技术有限公司。
1.3 芽胞杆菌的分离与鉴定芽胞杆菌的分离主要是参考刘国红等[12]的方法，37℃培养48 h，根据菌落大小、形态、颜色进行初步筛选分离并纯化。
芽胞杆菌基因组DNA提取采用酚氯仿法。采用细菌通用16S rRNA引物9F 5′-GAG TTT GAT CCT GGC TCA G-3′(9~27)和1542R 5′-AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3′(1 542~1 525)，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反应体系(25 μL)：2.5 μL 10× Buffer、0.5 μL 10 mmol·L-1 dNTP、引物各1 μL、0.3 μL(5 U·μL-1)的Taq酶和1 μL DNA模板。PCR反应程序：94℃ 预变性5 min，94℃变性30 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸90 s，35个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物的检测：取2.5 μL PCR产物，点样于1.5%的琼脂糖胶中，以100 bp Marker作为标准分子量，100 V电压，电泳40 min，EB染色，用凝胶成像系统观察结果。序列测定：检测出有条带的菌株PCR产物送至铂尚生物技术有限公司进行测序。
1.4 生物学特性耐盐性测定：NaCl质量分数设置8个梯度，分别为0%、2%、4%、5%、10%、15%、20%、25%，每个梯度3个重复，每瓶装液量为20 mL。采用150 mL三角瓶培养，装入上述液体培养基，无菌操作方式接菌，接种量为1%，30℃，180 r·min-1摇床培养48 h，采用UV-2550，测定600 nm处菌体吸光度值(OD600)。
耐碱特性测定：pH设置6个梯度，分别为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，每个梯度3个重复。采用250 mL三角瓶培养，装入上述液体培养基(2 mmol·L-1 NaOH溶液调节相应pH)，无菌操作方式接菌，接种量为1%，30℃，180 r·min-1摇床培养48 h，采用UV-2550，600 nm处测定菌体吸光度值(OD600)。
生化特征：生化特征指标采用商业生化鉴定系统。
1.5 数据分析将分离得到的19株菌进行16S rRNA序列在韩国网站(EZtaxon-e.ezbiocloud.net)上进行序列比对分析[13]，选择相关的参考菌株序列，再经Clustal X[14]对齐后，用软件Mega 4.0[15]进行聚类分析(方法为Neighbour-Joining，Nucleotide: Jukes-Cantor)，构建聚类树[16, 17, 18]。
2 结果与分析 2.1 种类分离通过温度和稀释涂布法从西藏尼玛县盐碱土壤样品中共分离出19株不同菌落形态特征的菌株(FJAT-24874至FJAT-24892)，颜色大致分为白色、淡黄色和黄色，以黄色为主，菌落直径约为2~3 mm，表面光滑、有光泽、不透明。
2.2 种类鉴定16S rRNA鉴定结果(表1)表明：5株为非芽胞杆菌，14株为芽胞杆菌，种类为3种，均为嗜碱芽胞杆菌类群，分别为假坚强芽胞杆菌Bacillus pseudofirmus、盐地咸海鲜芽胞杆菌Jeotgalibacillus campisalis和堀越氏芽胞杆菌Bacillus horikoshii。其中，11株与假坚强芽胞杆菌亲缘关系较近，其16S rRNA相似性为98.76%~98.90%；2株与堀越氏芽胞杆菌接近，相似性为98.83%~99.11%，分别为FJAT-24880和FJAT-24881；1株即FJAT-24879与盐地咸海鲜芽胞杆菌的16S rRNA相似性为99.58%。
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表1 分离菌株16S rRNA鉴定结果 Table 1 Identification on isolates from Xizang |
利用Mega 4进行系统进化分析，由图1可以得出，分为三大类群：类群I包含5株菌，与假坚强芽胞杆菌的亲缘关系较近，第II群由FJAT-24879组成，与盐地咸海鲜芽胞杆菌的亲缘关系较近；第III类群包含2株菌，与堀越氏芽胞杆菌具有较近的亲缘关系。
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图1 西藏盐碱地土壤中芽胞杆菌菌株系统发育分析 Fig.1 Phylogenetic tree of 13 Bacillus strains isolated from soil at Xizang |
8株芽胞杆菌的生化鉴定结果见表2。由表2得出，同种不同菌株间的生化特征具有一定的差异。8株菌的MR、丙二酸盐、VP、七叶苷、山梨醇、鼠李糖、木糖、明胶、西蒙氏枸橼酸盐和葡萄糖半固体反应均为阴性，都能利用甘露醇进行发酵(除了FJAT-24880)。
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表2 芽胞杆菌生化鉴定结果 Table 2 Bio-characteristics of isolates |
选取3株不同种类的芽胞杆菌进行耐盐特性分析。由图2可知，菌株FJAT-24879、FJAT-24881、FJAT-24884对NaCl的耐受性变化趋势基本相同，随着盐度的增加，生长量基本上呈先上升后下降变化趋势，3株菌的最适耐盐生长范围为5%～7%，15%时3株菌都几乎无生长。
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图2 不同浓度NaCl对嗜碱菌株生长的影响 Fig.2 Effect of NaCl concentration on growth of Bacillus species isolated |
3株菌FJAT-24879、FJAT-24881和FJAT-24884在pH7~10时都能生长，随着pH的增加，生长量均呈现先上升后下降趋势。FJAT-24881和FJAT-24884在pH范围为7~12，而FJAT-24879的pH范围为7~11。
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图3 pH对嗜碱芽胞杆菌菌株生长的影响 Fig.3 Effect of pH on growth of Bacillus species isolated |
近年来，嗜碱菌是国际上备受重视地具有重要开发价值的微生物资源。我国具有丰富的盐碱环境资源，如盐湖、碱湖、盐碱地、滩涂湿地等，大量文献报道这些盐碱环境中含有丰富的芽胞杆菌资源和功能资源开发潜力[19, 20, 21]。
16S rRNA基因是原核微生物鉴定种类最重要的标记，本研究从西藏尼玛县采集到的盐碱样品中获得了14株均为嗜碱芽胞杆菌，这可能与采集样品的特性有关。通过16S rRNA序列分析，得出这14株为2个属的3个种，其中假坚强芽胞杆菌B.pseudofirmus分布最广泛。目前，不同研究者已从不同碱性环境分离到了多种不同生物特性的假坚强芽胞杆菌菌株，如模式菌株B.pseudofirmus DSM 8715T[4]、嗜碱模式生物B.pseudofirmus OF4[22]、细胞色素c共价结合末端氧化酶的氧化还原电位B. pseudofirmus FTU[23]，腐殖质还原菌株B. pseudofirmus MC02[24]，产碱性蛋白酶的ZL22[2]及产碱性淀粉酶菌株703[25]等。本研究丰富了假坚强芽胞杆菌的菌株来源，进一步将研究这些菌株的功能，希望从中获得有应用价值的资源。
此外，生理生化检测发现同种不同菌株的生化特征具有一定的差异，这可能与嗜碱芽胞杆菌对环境的适应性及其自身的特性有一定的相关性。
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