黄酒酿造中有机酸代谢及微生物菌群结构的研究表明，乳酸、乙酸和琥珀酸为红曲黄酒的主要有机酸，这些酸源于曲中主要微生物霉菌^[1]、酵母菌^{[2, 3, 4]}和细菌^{[5, 6]}的共同作用。乳酸可由霉菌、酵母菌和细菌代谢葡萄糖生成^{[7, 8, 9]}；乙酸是乙醇发酵的伴生产物，主要由酵母菌代谢产生^[10]；琥珀酸是三羧酸循环的代谢中间产物，霉菌、酵母菌和细菌在有氧条件下均会生成^{[11, 12, 13]}。此外，酵母菌也可通过代谢异柠檬酸或谷氨酸生成少量琥珀酸^{[14, 15]}。

酵母菌是黄酒酿造的关键菌株，能把糖转化成乙醇，同时也代谢产酸，其产酸水平的高低将影响糖的乙醇转化力和所酿黄酒品质的优劣。红曲黄酒是福建特产，含有红曲色素、洛伐他汀等多种营养及功能物质，具有降血压、降血脂、抗肿瘤等多种生理功能，在黄酒产业发展史上独树一帜^{[16, 17, 18]}。但福建红曲黄酒普遍存在总酸较高的缺陷，其酸度多在7.0 g·L^-1以上，酒体入口酸刺激感突出，因此传统红曲黄酒在生产过程中需要添加糖度较高(＞150 g·L^-1)的重酿酒进行勾兑以改善口感。如何控制黄酒酸化已成为红曲黄酒产业亟须解决的问题之一。本试验研究酵母菌在红曲黄酒发酵过程中的乙醇发酵水平、酸代谢变化规律及其产酸组成，解析其酸代谢对黄酒酸化的影响，旨在为红曲黄酒酸化行为的调控机制提供基础，为高品质黄酒的酿造提供理论依据和技术支持。

酵母菌JH301：由本实验室选育并保存，最适生长pH值4.5~5.0。酵母菌JH183：由本实验室选育并保存，最适生长pH值4.0~4.5。安琪黄酒专用干酵母AQ：购于安琪酵母有限公司，最适生长pH值4.5~5.0。

其他试材 大米：永安圆糯米(市购)。α-淀粉酶：酶活力为2×10⁴ U·g^-1(上海晶纯试剂有限公司产品)。糖化酶：酶活力为10⁵ U·mL^-1(上海晶纯试剂有限公司产品)。麦芽汁培养基：可溶性固形物含量10%麦芽汁，使用乳酸及NaOH调节pH值至 5.4，121℃灭菌20 min，冷却备用。

酿酒酵母JH301、JH183、安琪黄酒专用干酵母AQ经麦芽汁培养基25℃培养24 h，备用。

大米糖化液：按m(米饭)∶m(水)=1∶1落缸，按淀粉酶、糖化酶用量，每公斤米饭分别添加α-淀粉酶和糖化酶3.5 g、5.6 mL，60℃酶解2 h，冷却，备用。酶解后基质固形物35%、总酸0.23 g·L^-1、pH值6.0。

取大米糖化液，按2%的接种量分别接入1.2.1制备的安琪黄酒专用干酵母AQ、酵母菌JH301、JH183，置于25℃下控温发酵，每天检测发酵液总酸及pH值，第5、15 d检测发酵液酒精度、有机酸组成及含量，研究各酵母菌的乙醇发酵水平、酸代谢变化规律及其产酸组成。各处理平行2次。

红曲黄酒酒精度、总酸含量的测定：均参照GB/T 13662-2008《黄酒》进行。有机酸含量的测定：按照文献^[19]的方法进行，离子排斥色谱法。可溶性固形物含量的测定：20℃条件下，使用精度为0.1%的折光仪测定。

通过DPS3.01软件进行分析。

由表1可知，各酵母菌的乙醇发酵能力各不相同。发酵15 d后，酵母菌JH301产乙醇水平最高，体积分数达15.8%，其次为安琪黄酒专用干酵母AQ(14.8%)，酵母菌JH183的产乙醇水平最低，仅为12.4%，差异均达极显著水平(P ＜0.01)。

表1(Table 1)

表1 发酵过程中酒精度的变化Table 1 Change of producing alcohol durling fermentation (单位/%) 酵母菌 0 d 5 d 15 d 酵母菌AQ 0 9.6±0.1 Bb 14.8±0.0 Bb 酵母菌JH301 0 10.8±0.1 Aa 15.8±0.1 Aa 酵母菌JH183 0 8.2±0.1 Cc 12.4±0.1 Cc

表1 发酵过程中酒精度的变化 Table 1 Change of producing alcohol durling fermentation

从图1可以看出，在发酵过程中酵母菌发酵液总酸均呈先快速增加、pH值快速下降到酵母适宜生长值区间后趋于平缓的趋势，酵母菌间的产酸水平存在差异。通过回归分析，结果表明，各酵母菌的产酸曲线均符合Log-Modified模型[Y=(a+b^*X)^c]：Y₁=(0.0254+1.2773^*X₁)^0.4497(AQ)，Y₂=(0.0349+1.0126^*X₂)^0.4479(JH301)，Y₃=(0.1359+0.6082^*X₃) ^0.7030(JH183)，方程回归均达极显著水平(P ＜0.01)；其中，c值大小与产酸能力呈正相关关系，可用于预判各酵母菌的产酸水平。酵母菌JH301和AQ在发酵5 d时、酵母菌JH183在发酵11 d时总酸快速上升，发酵液pH值迅速下降至各酵母菌适宜生长的区间(JH301、AQ为4.5~5.0，JH183为4.0~4.5)，日均产酸量分别为0.47、0.40、0.34 g·L^-1；JH301和AQ在发酵第6 d后、酵母菌JH183在发酵第11 d后发酵液总酸增加趋于平缓，日均产酸量分别为0.11、0.09、0.13 g·L^-1，pH值均维持在3.3~4.0。发酵15 d后，酵母菌JH301发酵液总酸含量最低，仅为3.26 g·L^-1，其次为安琪黄酒专用干酵母AQ(3.54 g·L^-1)，酵母菌JH183发酵液总酸含量最高，达4.57 g·L^-1，差异均达极显著水平(P ＜0.01)。

图1(Fig.1)

图1 酵母菌的产酸及pH值的变化 Fig.1 Produbing acid curve and change curve of pH value of yeast stiains

各酵母菌株发酵第5、15 d时产有机酸情况见表2。各酵母菌的有机酸主要组分均为乳酸、乙酸和琥珀酸，其含量均随着酒精发酵的进行而增加。发酵15 d后，安琪黄酒专用干酵母AQ、酵母菌JH301、JH183的有机酸产物最高的均为乳酸，分别占各自有机酸总含量的76.64%、76.68%和77.93%，其次均为乙酸，分别占各自有机酸总含量的18.06%、16.67%和16.93%，此外，各酵母菌发酵液均含有少量的琥珀酸。结果表明，酵母菌在发酵过程中酸代谢的主要产物为乳酸、乙酸和琥珀酸，分别占有机酸总量的(77.08±0.60)%、(17.22±0.60)%、(5.70±0.67)%。

表2(Table 2)

表2 各酵母菌株产有机酸水平Table 2 Organic acid production level of yeast stains [单位/(mg·L-1)] 组分 发酵前 发酵5 d 发酵15 d AQ JH301 JH183 AQ JH301 JH183 草酸 - - - - - - - 柠檬酸 - 20 38 11 - 2 - 酒石酸 - 6 26 15 - - - 苹果酸 - - 33 1 - - - 抗坏血酸 - - - - - - - 琥珀酸 - 136 157 92 180 201 212 乳酸 128 1766 1560 1590 2601 2318 3211 乙酸 - 490 468 546 613 504 698

表2 各酵母菌株产有机酸水平 Table 2 Organic acid production level of yeast stains

酵母菌通过EMP途径可代谢葡萄糖生成丙酮酸，并使丙酮酸进入以下2个代谢途径。A途径：丙酮酸在酵母菌乳酸脱氢酶(LDH)等酶作用下转化生成乳酸^{[7, 8, 9]}；B途径：丙酮酸在无氧条件下在酵母菌乙醇脱氢酶(ADH)作用下转化为乙醇，在甲酸裂解酶(PFL)作用下产生乙酸^[10]。酵母菌AQ、JH301最适生长pH值为4.5~5.0，JH183的最适生长pH值为4.0~4.5。在发酵初期，发酵基质中总酸含量较低，pH值高达5.73，此时酵母菌为将环境pH值调节至自身适宜pH值区间，迅速激活LDH等产乳酸酶启动A途径代谢葡萄糖产生乳酸，使总酸快速增加，pH值迅速下降。发酵3~4 d后，发酵液pH值达到酵母菌适宜生长的pH值，此时酵母菌LDH酶活开始受到抑制，乳酸的累积速度开始放缓，ADH和PFL酶被激活，酵母菌丙酮酸的A途径代谢受阻，激活了 B途径代谢，并伴随产生少量乙酸，因此发酵液总酸增加趋势开始趋于平缓，pH值缓慢下降。各酵母的产酸水平取决于酵母菌自身的生长特性及其代谢途径表达的差异。随着乙醇发酵的进行，发酵液中酒精度不断增加，较高的酒精度会抑制酵母细胞的生长^[20]，也会对酵母菌主要产酸酶LDH、PFL的酶活力产生阻遏，酒精度达15%时酵母菌丙酮酸代谢的A途径和B途径同时被切断，因此发酵15 d时酵母菌JH301、AQ的产酸水平已不再发生显著变化(P ＞0.05)。低产酸水平的酵母，可促使更多的葡萄糖由B途径代谢进行转化，从而提高乙醇产量、降低乳酸的产量，因此酵母菌的产酸水平与产乙醇能力呈负相关关系。

在红曲黄酒实际生产中，可选择添加产酸水平较低、乙醇发酵能力较高的酵母菌进行强化发酵，结合调控发酵基质的pH值至酵母菌适宜生长pH值，直接启动丙酮酸的B途径代谢进行乙醇发酵，阻遏丙酮酸的A途径代谢，减少乳酸的累积，抑制黄酒因酵母产酸引起的酸化，还可提高葡萄糖利用率，提高出酒率。