2016, Vol. 31
2. 福建农林大学园艺学院/茶学福建省高等学校重点实验室, 福建 福州 350002
2. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University/Key Laboratory of Tea Science at Universities in Fujian, Fuzhou, Fujian 350002, China
茉莉花Jasminum sambac(L.)Ait为木犀科Oleaceae素馨属Jasminum植物，是园林观赏植物的一种，也是闻名世界的香料作物。茉莉花花色洁白如玉、花香芬芳浓郁，用其窨制的茉莉花茶是“世界名茶”[1]。茉莉花为气质花,夜间开花，不开不香，其开放时间、释香量及持续时间直接影响着茉莉花茶质量的好坏。萜烯类香气成分是茉莉花香气物质中的一大类，如芳樟醇、法呢烯、石竹烯、橙花叔醇、依兰油烯和萜品醇等。GGPPS是植物萜烯类香气物质合成途径中的关键酶，也称香叶基香叶基焦磷酸合酶，其以牻牛儿基焦磷酸(geranyl pyrophosphate)为前体，合成牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate)，进而在不同酶的作用下分别生成二萜、四萜和多萜化合物。GGPPS是植物二萜、四萜和多萜类合成的关键酶，影响着类胡萝卜素等食品着色色素和抗氧化剂、萜烯类等香气和风味物质、泛锟等保健营养品、紫杉酚等抗虫抗癌症物质的形成，在植物次生代谢中扮演着重要角色[2-6]。
GGPPS基因已在白芥子Sinapis alba[7]、麻风树Jatropha curcas[8]、长春花Catharanthus roseus[9],三七Panax notoginseng[10]和肯尼亚番薯Ipomoea sp. Kenyan[11] 等植物中报道。在对橡胶草Taxus walliciana、甜椒Capsicum annuum及欧榛Corylus avellana L. Gasaway等植物GGPPS基因的研究中发现,基因组GGPPS基因不含内含子，为功能基因[12-14]；将GGPPS转基因到烟草中，可使烟草开花提早2个星期[15],可见GGPPS基因对植物开花有着一定的影响，但目前尚未见茉莉花GGPPS基因的相关报道，且GGPPS是否调控茉莉花开花及释香，以及其作用机理方面并未见报道。
本研究采用RACE和RT-PCR相结合的技术，克隆茉莉花GGPPS的全长cDNA序列，并对其进行生物信息学分析，预测其基因结构及功能。采用荧光定量PCR技术，检测该基因在花发育过程中的表达模式，以期为茉莉花香气形成机理的研究提供一定的参考。
1 材料与方法 1.1 供试材料及处理方法茉莉花来源于福建农林大学茉莉花种质资源圃，于傍晚采摘半开的茉莉花瓣(此时茉莉花朵呈虎爪状，香气最高)，液氮速冻，存放于超低温冰箱(-80℃)。
1.2 总RNA提取及cDNA第一链合成茉莉花总RNA采用Trizol法提取，cDNA第一链合成采用孙君等[7]的方法进行。
1.3 JsGGPPS保守区克隆参考苜蓿、丹参、长春花等植物GGPPS基因序列，采用DNAMAN软件设计保守区简并引物GGPPS-F和GGPPS-R(引物序列见表 1，引物由北京华大基因公司合成，下同)。PCR扩增体系：2.5 μL 10× Ex-Taq Buffer (Mg2+ Plus),4 μL dNTPs (2.5 mmol·L-1)，1 μL模板，0.5 μL GGPPS-R，0.5 μL GGPPS-F，0.2 μL Ex-Taq酶(5 U·μL-1),补ddH2O至25 μL体系。95℃预变性5 min，95变性30 s，53℃退火45 s，72℃延伸90 s，35个循环，最后72℃延伸10 min进行PCR扩增。将PCR产物纯化回收、并连接至pMD18-T载体，转化至Trans5大肠杆菌感受态细胞，测序(北京六合华大基因有限公司，下同)。
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表 1 引物序列 Table 1 Sequences of primers |
根据保守区克隆结果分别设计合成特异性5'RACE和3'RACE引物(Primer Premier 5软件)：5-GGPPS和3-GGPPS，将保守区PCR体系中引物改为0.5 μL 5-GGPPS/3-GGPPS，0.25 μL L4M，并补ddH2O至25 μL，将保守区PCR扩增程序中的退火温度提高至56℃进行PCR扩增。将PCR产物进行纯化回收、连接、转化、测序。
1.5 全长cDNA的获得及生物信息学分析将保守区、5'RACE及3'RACE的序列进行拼接，得到JsGGPPS的cDNA全长序列，在其ORF两端设计特异引物qGGPPS-R和qGGPPS-F扩增其全长序列。
JsGGPPS基因序列通过在线NCBI的BLAST功能进行氨基酸序列同源性比较；采用MEGA5.05将氨基酸序列作系统进化树(neighbor-joining)；在线Multalin 5.4.1软件进行多重序列比对；通过Protparam软件对其分子量、等电点进行预测，初步分析目的基因的功能；通过在线 预测蛋白质二级结构。
1.6 JsGGPPS基因在茉莉花不同花发育过程中的表达分析分别提取18:00、20:00、22:00、翌日00:00和2:00的茉莉花瓣总RNA(Trizol法)，并反转录成cDNA(TaKaRa逆转录试剂盒)，稀释10倍作模板。以Actin基因为内参基因(引物为Actin-I和Actin-II)，运用Primer Premier 5.0软件，设计荧光定量PCR引物rtGGPPS-R和rtGGPPS-F，参照SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit(TaKaRa)说明书，进行荧光定量PCR扩增。
1.7 数据统计与分析试验数据应用Microsoft Excel 2003软件进行整理分析、作柱状图；采用2-ΔΔCt法计算其相对表达量；应用SPSS软件对结果进行差异显著性分析。
2 结果与分析 2.1 JsGGPPS克隆及序列分析通过RT-PCR和RACE技术得到保守区、5'RACE和3'RACE的PCR产物如图 1所示,最终克隆得到保守区、5'RACE和3'RACE片段571、603、716 bp。利用特异性引物扩增其ORF(PCR产物如图 1所示)，得到ORF长度为1 083 bp。
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图 1 从茉莉花中分离的JsGGPPS电泳 Figure 1 Amplified product of JsGGPPS from J. sambac 注：M：Marker DL2000；1：保守区扩增产物；2：5'RACE扩增产物；3：3'RACE扩增产物；4：JsGGPPS ORF全长扩增产物。 |
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图 2 JsGGPPS基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Figure 2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of JsGGPPS
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将保守区、5'RACE和3'RACE序列拼接并进行生物信息学分析，结果表明，JsGGPPS的全长cDNA为1 410 bp，含1个完整ORF：245～1 327 bp，包含起始密码子ATG和终止密码子TGA及18个A的Poly A尾巴。该基因c编码的蛋白属于trans-isoprenyl diphosphate synthases(IPPS)和class I terpene cyclases家族，含链长控制区(CLDR)，含天冬氨酸富含区1及底物Mg2+结合部位(SARM)、天冬氨酸富含区2(FARM)。JsGGPPS基因推导的氨基酸序列包含360个氨基酸,分子总量为39 274.2 D，等电点为5.91，带正电氨基酸为39，带负电氨基酸为46，分子式为C1743H2799N467O525S18。不稳定系数为40.21，为不稳定蛋白。脂溶指数为94.31，亲水性平均值为-0.070。亚细胞定位在细胞质上。二级结构中43.89 %为α螺旋(158)，14.17%为延伸链(51)，10.65%为β转角(38)，31.39%为不规则卷曲(113)。
JsGGPPS基因编码的氨基酸序列经BLAST比对，与独行菜Lepidium apetalum、橡胶草Taraxacum kok-saghyz、 杜仲Eucommia ulmoides、岩蔷薇Cistus creticus、蒺藜状苜蓿Medicago truncatula 及潘那利番茄Solanum pennellii的同源性分别为91%、86%、85%、84%和80%。采用MEGA5.05功能将各个氨基酸序列作系统进化树，结果(图 3)表明，茉莉花JsGGPPS氨基酸序列与独行菜属的独行菜Lepidium apetalum亲缘关系最近，与毛莨科的巴基斯坦夏侧金盏花(Adonis aestivalis var. palaestina)亲缘关系最远。
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图 3 JsGGPPS基因系统进化树 Figure 3 Phylogenetic tree of JsGGPPS |
将这些相对保守的植物GGPPS氨基酸序列导入在线Multalin 5.4.1软件进行多重序列比对，结果(图 4)表明，JsGGPPS在5’端前90个氨基酸位点保守性较低，在之后的90~373位点氨基酸保守性较高。
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图 4 JsGGPPS氨基酸多重序列比较 Figure 4 Alignment of amino acid sequence of JsGGPPS |
以茉莉花Actin基因为内参，采用实时荧光定量PCR对茉莉花开放过程中JsGGPPS基因的表达模式进行了分析，结果(图 5)表明，茉莉花在晚上18:00时表达量较低，随着时间的推移呈上调趋势，在晚上22:00时达到最高，随后呈下调趋势，在翌日0:00时表达量已低于18:00时，在翌日2:00表达量最低。
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图 5 茉莉花开放过程中JsGGPPS基因表达分析 Figure 5 Expression of JsGGPPS during blooming 注：图中不同字母代表不同时刻间存在显著差异(P＜0.05)。 |
萜烯类香气成分是茉莉花香气物质中的一大类，GGPPS是植物萜烯类香气物质合成途径中的关键酶。克隆得到JsGGPPS基因全长cDNA 1 410 bp，含一个完整的开放阅读框(ORF)：245～1 327 bp，包含起始密码子ATG和终止密码子TGA及18个A的Poly A尾巴。该蛋白属于trans-isoprenyl diphosphate synthases(IPPS)和class I terpene cyclases家族，含链长控制区(CLDR)，具有GGPPS合酶家族的两个富含天冬氨酸的特征性序列DDXX(XX)D。Hemmi等[17]研究表明，SARM和FARM这两个天冬氨酸富含区是酶的催化活性位点，参与构成与IPP和烯丙基底物相结合的活性结构。此外，茉莉花JsFPPS氨基酸序列[18]亦具有此2个富含天冬氨酸的特征序列,茉莉花萜烯类合酶JsTPS氨基酸序列[19]亦具有DDXXD这一天冬氨酸富含区，与杨滢[20]认为的短链异戊烯基转移酶均含有2个天冬氨酸富含区DDXX(XX)D,FPPS和GGPPS氨基酸序列的2个天冬氨酸富含区DDXX(XX)D具有高度保守性的研究结果相一致。同时，在其他植物的研究中也发现，麻风树Jatropha curcas、银杏Ginkgo biloba、橡胶草Taxus walliciana及啤酒花Humulus lupulus等植物的GGPPS氨基酸序列均含有2个天冬氨酸富含区[8, 12, 21-22]。茉莉花JsGGPPS氨基酸序列与其他植物有较高的同源性，与独行菜Lepidium apetalum、橡胶草Taraxacum kok-saghyz和杜仲Eucommia ulmoides的同源性分别为91%、86%和85%，在今后可借鉴这些植物的研究模式，进一步深化茉莉花JsGGPPS及其他香气相关基因的研究，探究茉莉花开放与释香的机理。
茉莉花为夜间开放的气质花，研究其香气相关基因的表达模式具有一定的意义。前人已对一些其他植物GGPPS做了表达研究，认为GGPPS基因的表达存在组织特异性。Liu等[23]研究结果表明,三七Panax notoginseng的GGPPS基因在3年生根、茎、叶、花中表达，以3年生叶的表达量相对最高。Hua等[24]研究表明，丹参Salvia miltiorrhiza的GGPPS基因主要在叶中特异表达，黑暗、高温、病原菌、机械损伤，盐溶液、赤霉素、脱落酸和水杨酸等几种因子可诱导该基因的表达上调。Wang等[14]研究表明,欧榛Corylus avellana L. Gasaway的GGPPS基因在叶子中相对表达最高。Li等[6]研究表明，GGPPS基因的转录水平同紫杉醇表现一定的相关性。前人对GGPPS表达模式的研究多以不同器官(空间)为对象，其表达的节律性(时间)还鲜见报道。采用实时荧光定量PCR技术检测茉莉花开放过程中的表达模式表明，在晚上18:00至翌日2:00茉莉花发育过程中，该基因的表达为先上调后下调，以22:00最高，且在翌日0:00时茉莉花已完成开放时表达量低于晚上18:00茉莉花未开待开时。JsGGPPS基因的表达模式与茉莉花开放释香过程相一致，与茉莉花香气相关基因JsDXS、JsHMGR、JsSAMT、JsPAL、JsFPPS[18]、JsTPS[19]及CDS、HPL[25]的表达模式基本一致，推测茉莉花JsGGPPS基因参与调控茉莉花香气物质的代谢，但其具体参与方式还需要进一步研究验证。
| [1] |
杨江帆, 吴建成, 叶乃兴, 等. 茉莉韵. 北京: 科学出版社, 2015 .
( 0)
|
| [2] |
WATTS K T, MIJTS B N, SCHMIDT-DANNERT C. Current and emerging approaches for natural product biosynthesis in microbial cells[J]. Advanced Synthesis&Catalysis, 2005, 347 (7-8) : 927 –940.
(0)
|
| [3] |
HAYNES R K, KRISHNA S. Artemisinins:activities and actions[J]. Microbes and infection, 2004, 6 (14) : 1339 –1346.
(0)
|
| [4] |
CHEMLER J A, YAN Y, KOFFAS M A G. Biosynthesis of isoprenoids, polyunsaturated fatty acids and flavonoids in Saccharomyces cerevisiae[J]. Microbial Cell Factories, 2006, 5 (1) : 1 .
(0)
|
| [5] |
JENNEWEIN S, CROTEAU R. Taxol:biosynthesis,molecular genetics, and biotechnological applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2001, 57 (1-2) : 13 –19.
(0)
|
| [6] |
LI L Q, FU C H, ZHAO C F, et al. Efficient extraction of RNA and analysis of gene expression in a long-term Taxus cell culture using real-time RT-PCR[J]. Zeitschrift für Naturforschung C, 2009, 64 (1-2) : 125 –130.
(0)
|
| [7] |
LAFERRI RE A, BEYER P. Purification of geranylgeranyl diphosphate synthase from Sinapis alba etioplasts BBA-protein struct[J]. Mol Enzymol, 1991 (1077) : 167 –172.
(0)
|
| [8] |
LIN J, JIN Y J, ZHOU X, et al. Molecular cloning and functional analysis of the gene encoding geranylgeranyl diphosphate synthase from Jatropha curcas[J]. Afr J Biotechnol, 2010 (9) : 3342 –3351.
(0)
|
| [9] |
THABET I, GUIRIMAND G, GUIHUR A, et al. Characterization and subcellular localization of geranylgeranyl diphosphate synthase from Catharanthus roseus[J]. Mol Biol Rep, 2012 (39) : 3235 –3243.
(0)
|
| [10] |
MIN D D, TANG M Q, LI G, et al. Cloning and expression analysis of GGPPS gene from Panax notoginseng[J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2015, 40 (11) : 2090 –2095.
(0)
|
| [11] |
YAMAMIZO C, KISHIMOTO S, OHMIYA A. Carotenoid composition and carotenogenic gene expression during ipomoea petal development[J]. J Exp Bot, 2010, 61 (3) : 709 –719.
(0)
|
| [12] |
LAN X Z, AUN M. Cloning and characterization of the geranylgeranyl diphosphate synthase gene in Taxus walliciana[J]. J. Southwest Agric. Univ, 2006, 28 : 537 –543.
(0)
|
| [13] |
BADILLO A, STEPPUHN J, DERU RE J, et al. Structure of a functional geranylgeranyl pyrophosphate synthase gene from Capsicum annuum[J]. Plant molecular biology, 1995, 27 (2) : 425 –428.
(0)
|
| [14] |
WANG Y, MIAO Z, TANG K. Molecular cloning and functional expression analysis of a new gene encoding geranylgeranyl diphosphate synthase from hazel (Corylus avellana L[J]. Molecular biology reports, 2010, 37 (7) : 3439 –3444.
(0)
|
| [15] |
TATA S K, JUNG J, KIM Y H, et al. Heterologous expression of chloroplast-localized geranylgeranyl pyrophosphate synthase confers fast plant growth, early flowering and increased seed yield[J]. Plant biotechnology journal, 2016, 14 (1) : 29 –39.
(0)
|
| [16] |
孙君, 陈桂信, 叶乃兴, 等. 茉莉花香气相关基因JsDXS及其启动子的克隆与表达分析[J]. 园艺学报, 2014 (6) : 1236 –1244.
(0)
|
| [17] |
HEMMI H, NOIKE M, NAKAYAMA T, et al. An alternative mechanism of product chain-length determination in type III geranylgeranyl diphosphate synthase[J]. Eur J Biochem, 2003, 270 (10) : 2186 –2194.
(0)
|
| [18] |
孙君. 茉莉花香气合成相关酶基因克隆与表达分析[D]. 福州:福建农林大学, 2014.
(0)
|
| [19] |
俞滢, 陈丹, 孙君, 等. 茉莉花萜类合成酶基因JsTPS 的克隆及其表达分析[J]. 园艺学报, 2016, 43 (2) : 356 –364.
(0)
|
| [20] |
杨滢. 植物萜类代谢途径关键酶的比较及其在丹参中的表达分析[D]. 西安:陕西师范大学, 2012.
(0)
|
| [21] |
WANG G, DIXON R A. Heterodimeric geranyl (geranyl) diphosphate synthase from hop (Humulus lupulus) and the evolution of monoterpene biosynthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2009, 106 (24) : 9914 –9919.
(0)
|
| [22] |
LIAO Z, CHEN M, GONG Y, et al. A new geranylgeranyl diphosphate synthase gene from Ginkgo biloba, which intermediates the biosynthesis of the key precursor for ginkgolides[J]. DNA Sequence, 2004, 15 (2) : 153 –158.
(0)
|
| [23] |
LIU M H, YANG B R, CHEUNG W F, et al. Transcriptome analysis of leaves, roots and flowers of Panax notoginseng identifies genes involved in ginsenoside and alkaloid biosynthesis[J]. Bmc Genomics, 2015 (16) : 265 .
(0)
|
| [24] |
HUA W, SONG J, LI C, et al. Molecular cloning and characterization of the promoter of SmGGPPs and its expression pattern in Salvia miltiorrhiza[J]. Molecular biology reports, 2012, 39 (5) : 5775 –5783.
(0)
|
| [25] |
欧雪凤. 双瓣茉莉花HPL与GDS基因克隆与分析[D]. 福州:福建农林大学, 2012.
(0)
|