2016, Vol. 31
2. 福建农林大学菌物研究中心, 福建 福州 350002;
3. 福建省农业科学院食用菌研究所, 福建 福州 350014
2. Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China;
3. Edible Fungi Institute of Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350014, China
毛木耳Auricularia polytricha(Mont.) Sacc.属木耳目，木耳科，木耳属，木耳种，素有“树上海蜇皮”之美称，质地脆滑，清新爽口[1],其食药兼用，是热带和亚热带地区主要食用菌之一。漳州市生产白背毛木耳有着得天独厚的气候条件，是国内白背毛木耳的主产区[2]，栽培面积大而且广泛，据统计，漳州市2015年栽培白背毛木耳1.6亿袋，产量11.30万t，产值高达3.34亿元，具有较好经济效益。但是目前漳州白背毛木耳生产中品种单一，主要是以漳耳43-28为主栽品种，造成栽培者风险大，一旦菌种出现老化、退化现象，市场上又没有可以替代的品种的话，将给栽培者造成巨大的经济损失，不利于毛木耳产业的健康发展。另一方面，随着经济的发展，市场的多元化，消费者对于毛木耳的需求，也更加多样化，对毛木耳的质量、口感、品质、色泽等要求增多，这也迫使毛木耳产业必须增加栽培品种，以满足市场的需要。因此选育毛木耳优良品种，成为支撑毛木耳产业健康发展的重要内容。作为育种的首要任务是毛木耳亲本菌株的选择，本课题在前期研究[3]的基础上,选用4株毛木耳菌株，进行菌丝形态观察、栽培出耳对比农艺性状，并通过ITS测序，明确菌种身份，构建系统发育树，以期为今后育种工作提供亲本和理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试菌株供试菌株4个，其基本特征特性见表 1。
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表 1 供试菌株 Table 1 Mushroom strains used in experiment |
培养基：(1)PDA固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL，pH自然；(2)PDA液体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然；(3)再生培养基：酵母膏5g、麦芽糖5 g、甘露醇0.6 mol·L-1、葡萄糖10 g、琼脂20g加入1 L水中煮至琼脂全部融化后，装三角瓶121℃灭菌20 min后备用；(4)栽培袋培养基：木屑78%、麸皮20%、轻质碳酸钙2%。
试剂：稳渗液、2%溶壁酶、CTAB抽提液、CTAB沉淀液、CTAB/NaCl、TE 缓冲液为实验室自配、其他试剂DNA Marker、10×buffer、rTaq酶、dNTPs等均购自TaKaRa公司(大连)，其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。ITS引物，购自上海生工，稀释后浓度为10 μmol·L-1。
1.3 试验方法 1.3.1 菌丝培养将活化好的毛木耳菌块接入平板培养基上,24℃培养至菌丝长满培养皿。
1.3.2 供试菌株菌落形态在长满菌丝的平板中，使用直径1 cm的打孔器在平板培养基上打孔，挑取孔洞中留下的菌块接入PDA 培养基的平板中心，置于 24℃生化培养箱中培养，待菌丝即将长满平板时进行拍照观察。
1.3.3 供试菌株复壮采用原生质体复壮法，取幼嫩的菌丝体用无菌水和甘露醇各洗1次。加入2%浓度的溶壁酶，30℃水浴2.5~3.0 h。离心过滤取200 mL涂布再生培养基平板，于25℃静置培养40~48 h后挑取再生菌株，镜检有锁状联合的且生长旺盛的菌株用于栽培出耳。
1.3.4 供试菌株出耳采用漳州常规的发酵料栽培岀耳，培养料经过预湿、建堆、翻堆发酵后，确保含水量适宜，约含水量63%，即可装袋。栽培袋采用聚乙烯塑料袋，袋子规格为17 cm×39 cm，厚度0.045 cm。采用机械装袋每袋装干料约0.5 kg。常规方法灭菌和接种，养菌时加强通风，一般接种后40~50 d菌丝即可长满菌袋。当气温基本稳定在25℃时可开袋出耳，出耳管理方法与目前生产上常规方法一致。当耳片颜色转淡并充分舒展、边缘开始卷曲时即可采收，采收前1周应停止喷水。半干的鲜耳采收好后及时晒干，分别统计各处理的产量。由于第3潮产量低，品质差，经济效益极低，本研究只统计前两潮干耳产量。
1.3.5 提取DNA根据植物基因工程CTAB法[4]，改进后提取供试菌株的DNA。
1.3.6 ITS序列扩增及测序分析用引物ITS1、ITS4对样品进行PCR扩增，PCR扩增体系为1.0 μL DNA模板，2.5 μL 10×PCR缓冲液(含MgCl2),[JP]2.0 mL dNTP(2.0 mmol·L-1),1.0 μL引物(10 μmol·L-1)，0.3 μL Taq聚合酶(5 U·μL-1),最后加ddH2O补充至总体积为25 μL。
ITS-PCR程序：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。
ITS-PCR产物的检测：琼脂糖凝胶(含0.5 μg·mL-1 GoldviewTMDNA染料)电泳。
ITS片段的克隆与测序：按照pMD18-TVector的说明书进行操作。阳性克隆经PCR验证后，委托上海生工进行测序。
2 结果与分析 2.1 菌丝形态试验结果见图 1。从图 1可以观察到4株供试菌株在平板上菌丝的生长情况，其中菌丝生长势最强的为菌株AP201，菌丝生长速度快，洁白，浓密。其次为AP2010，菌丝生长也较快，浓密，边缘整齐。漳耳43-28和43012的气生菌丝浓密而旺盛，但边缘不整齐，菌丝生长速度较慢。
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图 1 4个菌株平板上的菌丝形态 Figure 1 Morphological appearance of mushrooms 注：A为AP2010；B为43012；C为AP201；D为43-28。 |
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图 2 毛木耳原生质体复壮活化 Figure 2 Monokaryotization by protoplast rejuvenation technique |
4个毛木耳菌株在再生培养基中经过48 h培养后即可再生出芽管，通过镜检挑取的再生菌株，查看是否具有锁状联合结构。选取出较好的菌株，长势好的再生菌株用于出耳试验。
2.3 4个菌株的农艺性状从表 2可以看出4个菌株中AP201和AP2010菌株子实体的产量均高于当地主栽种，4个供试菌株产量最高的是菌株AP201，产量高达96.79 g·袋-1,比主栽的漳耳43-28产量提高37.14%。产量第二为菌株AP2010，比主栽的漳耳43-28产量提高17.96%。而且AP201和AP2010菌株耳片更厚，但其腹面棱脊多，边缘卷曲不适合生产销售。虽然主栽菌株漳耳43-28、43012在产量方面不具有优势，但耳片商品性状好，抗性强，适应粗放管理。菌株43012为漳耳43-28组织分离的稳定的菌株，从试验中也可以观察到毛木耳采用组织分离的方法得到的菌株在产量、性状上都优于出发菌株。43012产量比漳耳43-28提高9.85%。
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表 2 供试菌株产量及农艺性状 Table 2 Average yield and morphological characteristics of mushrooms |
从图 3中可以看出4个供试菌株形态特征差异较大。其中2株引进菌株在颜色上有着明显的差异，菌株AP2010鲜耳耳片白色，菌株AP201鲜耳耳片偏红褐色，而漳耳43-28和43012菌株鲜耳耳片颜色为紫褐色。耳片形态方面，菌株AP201耳片多、厚，丛生，但耳片边缘卷曲，腹面棱脊多，呈网状，不适合加工销售。菌株AP2010的耳片绒毛多，晒干后，耳片黄白色。而当地主栽品种漳耳43-28及43012的耳片则更饱满，平整，绒毛更白更密，且棱脊较少，商品性状优势十分明显。
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图 3 4个供试菌株子实体形态 Figure 3 Morphologies of fruiting body of mushrooms |
用ITS1、ITS4引物对供试菌株进行扩增，序列片段在572~588 bp(图 4)。从genBank网站上下载毛木耳FJ617292.1、黑木耳FJ478123、皱木耳AF291269.1、毡盖木耳AF291271、琥珀木耳AF291270以及金耳AY866425.1的序列，通过Mega 6.0软件进行比对分析，得到遗传距离的进化树(图 5)，观察其同源性。木耳属中有6个种类，黑木耳、毛木耳、皱木耳、毡盖木耳、黑皱木耳及褐毡木耳[5]，其中黑皱木耳被认为是皱木耳。从进化树中可以看出，琥珀木耳与毛木耳遗传距离更近一些，黑木耳与皱木耳关系较远，应该是2个不同的种，4个菌株与毛木耳FJ617292.1遗传距离很近，在一个分枝上，应该都属于毛木耳。
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图 4 ITS-PCR电泳结果 Figure 4 ITS-PCR electrophoretogram 注：1~5泳道分别为AP2010、43-28、43102、AP201、CK。 |
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图 5 4个菌株的ITS序列根据NJ法构建的系统进化树 Figure 5 Phylogenetic trees of mushrooms by neighbor-joining method |
DNA分子标记在木耳属真菌研究中已经取得了一系列的进展，显示了其在木耳种质资源研究中应用的广阔前景。张丹等[6]对毛木耳的7株菌株进行ITS序列比较分析,遗传图谱表明毛木耳能够同其他种区分开归属于统一分组中。王晓娥等[7]以木耳属22个菌株为供试材料，研究了rDNA-ITS序列作为木耳属条形码的可行性，经试验验证，种内ITS序列差异度为0.5%～2.5%，种间序列差异度为4.8%～10.8%。表明ITS序列可以区分木耳属的不同种，可以作为DNA条形码使用。本研究采用ITS序列分析比较供试菌株，发现4个菌株与毛木耳FJ617292.1遗传距离很近，在一个分枝上，应该都属于毛木耳。
伍虹蓉[8]采用原生质体再生、尖端分离和组织分离等3种方法提纯复壮黄耳10号和琥珀木耳,结果表明在同等情况下，采用不同的提纯复壮技术在不同的菌株上效果不一定相同，按增产率比较发现原生质体再生方法复壮效果最好。本研究参考该研究结论采用原生质体再生法提纯复壮白背毛木耳菌种。但是是否是最佳的白背毛木耳提纯复壮方法还有待于进一步的研究。
白背毛木耳主要用于出口，近年来，漳州沿用的菌种不断退化，导致产量下降，病虫害严重[9]，因此，迫切需要引进或选育出新种，保证毛木耳栽培品种的多样性，促进毛木耳产业的发展。本研究通过对供试菌株的菌丝形态、出耳性状的比较，提取DNA进行ITS序列分析对比，发现4个供试菌株性状差异大。AP2010菌株有着独特的颜色性状，为黄背毛木耳的白色变异菌株，白色食用菌产品已成为发展趋势，其中最早发现白化菌株且研究最多的是白色金针菇菌株，其是由日本Yutaka Kitamoto发现并培育的，目前已经成为金针菇的主要栽培品种。目前市场上毛木耳主要是正面紫褐色，晒干后为黑色，腹面白色。而整朵毛木耳为白色的菌株稀少，因此白色的毛木耳菌株具有较好的市场前景。菌株AP201为黄背毛木耳与白背毛木耳杂交的菌株，具有耳片丛生、产量高的特点，而漳耳43-28、43012具有商品性状好、朵形漂亮、抗性强、性状稳定的特点。结果表明4株供试菌株在农艺性状上具有明显的差异，各有优势，对4株供试菌株进行杂交，杂交后子代能够获得双亲优良性状的可能性会更大，可以为育种提供丰富的遗传多样性。
| [1] |
常明昌. 食用菌栽培学. 北京: 中国农业出版社, 2003 .
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张丹凤, 郑丽珠, 陈国平, 等. 白背毛木耳 43-28胞外多糖的提取与纯化[J]. 安徽农业科学, 2010, 38 (31) : 17461 –17462.
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袁滨, 张金文, 柯丽娜, 等. 毛木耳新菌株比较试验初报[J]. 食用菌, 2012 (1) : 19 –24.
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胡银岗. 植物基因工程. 杨凌: 西北农林科技大学出版社, 2006 .
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张丹, 郑有良. 毛木耳(Auricularia polytricha)的研究进展[J]. 西南农业学报, 2004 (5) : 668 –673.
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张丹, 郑有良, 陈红, 等. 中国7个毛木耳(Auricularia polytricha)菌株ITS序列比较[J]. 应用与环境生物学报, 2007 (2) : 166 –171.
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王晓娥, 姚方杰, 张友民, 等. 木耳属菌株ITS序列作为DNA条形码的可行性[J]. 东北林业大学学报, 2013 (7) : 111 –114.
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伍虹蓉.毛木耳菌种复壮技术研究[D].福州:福建农林大学, 2012.
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袁滨, 张金文, 柯丽娜, 等. 白背毛木耳菌株栽培对比试验[J]. 北方园艺, 2012 (21) : 131 –134.
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