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  福建农业学报  2016, Vol. 31 Issue (5): 465-470  DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2016.05.005
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焦云, 舒巧云, 刘珠琴。杨梅endo-PG基因单核苷酸多态性(SNP)分析[J]. 福建农业学报, 2016, 31(5): 465-470. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2016.05.005.
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JIAO Y, SHU Q-Y, LIU Z-Q. Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Analysis of the Endopolygalacturonase Gene in Chinese Bayberry (Myrica rubra)[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences, 2016, 31(5): 465-470. DOI: 10.19303/j.issn.1008-0384.2016.05.005.
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基金项目

宁波市农业科学研究院院长基金项目(2015NKYP001)

作者简介

焦云(1983-),男,副研究员,博士,研究方向:果树遗传育种与栽培技术(E-mail:jydyx@163.com)

文章历史

收稿日期：2015-11-19 初稿
2016-01-13 修改稿
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
杨梅endo-PG基因单核苷酸多态性(SNP)分析
焦云, 舒巧云, 刘珠琴    
浙江省宁波市农业科学研究院林业研究所, 浙江 宁波 315040
收稿日期：2015-11-19 初稿; 2016-01-13 修改稿
作者简介：焦云(1983-),男,副研究员,博士,研究方向:果树遗传育种与栽培技术(E-mail:jydyx@163.com)
基金项目：宁波市农业科学研究院院长基金项目(2015NKYP001)
摘要: Endo-PG基因在果实肉质变化以及后熟软化过程中发挥重要作用。采用PCR直接测序法对45份杨梅试材中endo-PG基因的部分DNA序列进行单核苷酸多态性分析,测序总长度为1866 bp,共发现178个SNP,其中,单现突变位点为60个,简约信息位点为118个,核苷酸多态性值(Pi)为0.27。通过单倍型分析发现在45份杨梅试材中的endo-PG基因存在12种单倍型。基于邻接法NJ构建endo-PG基因系统进化树,结果表明45份杨梅试材被划分为4个组,聚类结果与果实硬度存在一定联系;此外,‘荸荠’等品种存在2种等位基因,且两者差异较大,被划分于不同分组;而‘东魁’等品种纯合度相对较高。
关键词: 杨梅    endo-PG    SNP    
Single Nucleotide Polymorphism (SNP) Analysis of the Endopolygalacturonase Gene in Chinese Bayberry (Myrica rubra)
JIAO Yun, SHU Qiao-yun, LIU Zhu-qin    
Institute of Forestry, Ningbo Academy of Agricultural Science, Ningbo, Zhejiang 315040, China
Abstract: Endo-PG plays an important role in the ripening of Chinese Bayberry (Myrica rubra) fruit by causing its softening and inducing textural changes. 45 Chinese Bayberry accessions were tested to detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the endo-PG gene by PCR-based sequencing of a 1866 bp long DNA fragment. A total of 178 SNPs were identified, of which 60 were singleton variable sites and another 118 were parsimony informative sites. The nucleotide diversity value (Pi) was 0.27. A total of 12 haplotypes were identified and a dendrogram was constructed for endo-PG using the neighbor-joining (NJ) clustering method. The results indicated that the 45 accessions were clustered into four groups and that the clustering correlated with fruit hardness. Additionally, some cultivars (e.g. ‘Biqi’) were found to have two alleles, conferring pronounced phenotypic differences between allelic combinations and could thus be divided into different groups, while some other cultivars (e.g. ‘Dongkui’) had relatively high homozygosity.
Key words: Chinese Bayberry (Myrica rubra)    endo-PG    SNP    

细胞壁降解酶有很多种，包括内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)、果胶酯酶(PME)、纤维素酶(Cx)等。其中，内切多聚半乳糖醛酸酶(endo-PG)是随机在多聚半乳糖醛酸的α-(1,4)-半乳糖糖昔键进行水解，将果实细胞壁中多聚半乳糖醛酸降解为寡聚半乳糖醛酸和半乳糖醛酸[1]。研究表明，桃果实成熟后的肉质差异和软化速度与endo-PG酶活性增强密切相关，这在苹果、番茄、香蕉等果实成熟软化中也得到证实[2, 3]。

前人的研究主要集中在分析endo-PG酶活性及编码基因表达水平方面，对该基因序列中SNP位点的相关分析较少[4, 5]。据Hayama等[6]研究结果表明，2个桃品种中endo-PG基因片段(1 172 bp)共计检测出31个SNP位点，插入/缺失位点共有2个，其长度分别为17 bp和2 bp。由此可见，endo-PG基因具有较高的遗传多样性。此外，有关研究表明，这些SNP位点中部分与肉质和粘离核性状呈显著性关联[7, 8]。通过对该基因的多态性以及与果实相关性状的关联分析，可为今后分子标记辅助选择育种奠定理论与技术基础。

单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单核苷酸变异所引起的一种序列多态性[9]。在所有可能的DNA序列差异性中，单核苷酸多态性是发生频率最高的变异。单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点，在小麦、玉米等作物的物理作图、进化研究与遗传研究中也是很有效的分子标记[10]。目前，单核苷酸多态性(SNPs)广泛地用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、品种鉴定和分子标记辅助育种(MAS)[11, 12, 13, 14]。本课题组在前期研究中已经对杨梅进行全基因组测序，测序结果为后续相关研究提供重要的序列信息基础。本研究采用直接PCR测序法筛查45份杨梅试材中endo-PG基因的单核苷酸多态性，以期为研究endo-PG基因与杨梅果实硬度等品质的遗传特性以及分子标记辅助育种奠定基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

从我国南方不同省份收集45份杨梅试材，分别从其健康植株上采集无病虫害的嫩叶，放入预先准备好的液氮中迅速冷冻，然后转入-80℃冰箱中保存。

1.2 试验方法 1.2.1 杨梅endo-PG基因特异性扩增引物设计

基于前期研究中杨梅全基因组DNA测序结果，使用软件BioEdit Version 7.2( http://bioedit.software.informer.com/7.2/)构建本地Blast数据库，搜索与桃endo-PG(GenBank Accession No.DQ659241.1)的同源序列，然后使用软件Primer premier 5.0和Oligo 6.0进行特异引物设计，由上海英骏生物技术有限公司合成，用超纯水溶解，供试引物如表 1所示。

表 1 供试引物 Table 1 List of primers used in this study
1.2.2 叶片基因组DNA提取与PCR扩增

本研究均使用快速离心柱型植物基因组DNA提取试剂盒(目录号：DP3112，百泰克)。使用试剂盒Premix TaqTM Hot Start Version(目录号：R028A，TaKaRa)进行PCR扩增；反应条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸2 min，32个循环；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR产物(浓度>50 ng·μL-1)直接交由上海桑尼生物科技有限公司进行回收、纯化及双向测序。

1.2.3 序列拼接与分析

使用软件DNAstar中子程序SeqMan对测序结果进行拼接及编辑；使用软件DnaSP5.0计算分析基因序列多样性(π)、核苷酸多态性(θ)及单倍型多样性等；使用软件MEGA Version 5.05并基于邻接法(Neighbor-Joining)构建基因系统进化树。

2 结果与分析 2.1 杨梅试材来源、DNA提取和PCR扩增

从不同地区采集45份杨梅试材的嫩叶，分别来源于浙江省(32份)、江西省(1份)、广东省(4份)、江苏省(5份)、湖南省(2份)和日本(1份)，果实颜色等相关信息见表 2。

表 2 供试45份杨梅及其果色与来源 Table 2 Varieties,fruit colors and sources of 45 Chinese bayberry accessions used in this study

提取所有杨梅试材嫩叶中基因组DNA，提取效果见图 1-A。然后，使用表 1中的引物在45份杨梅试材基因组DNA模板上进行PCR反应(图 1-B)，扩增产物经电泳检测后发现其条带清晰、单一，且与目的片段大小相符，表明该引物特异性较好，便于后续回收及纯化等操作。在获得片段测序结果后，使用软件DNAstar中子程序SeqMan对测序结果进行拼接及编辑。

图 1 基因组DNA(A)以及endo-PG基因片段PCR扩增产物(B)在1%琼脂糖胶上电泳检测的结果 Fig. 1 The 1% agarose gel electrophoresis of the genome DNA of partial accessions (A) and the PCR product of the partial endo-PG gene (B) 注：B中1~2为引物MR-PG3扩增结果，3和4分别为引物MR-PG1和MR-PG2的扩增结果。
2.2 Endo-PG基因单核苷酸多态性

通过对测序结果进行拼接及编辑，共计获得59条高质量endo-PG基因DNA序列片段，序列长度为1 866 bp；其中包括60个单现突变(Singleton variable sites)和118个简约信息位点(Parsimony informative sites)，基因序列保守区域为495 bp，Pi和K平均值分别为0.27和458.747，由此可见，该基因具有较高的遗传多样性。在这些变异位点中，有3种突变类型。此外，1 139个简约信息位点中有798个为二变异体，314个为三变异体，其余的27个均为四变异体。在二变异体中，共发现348个置换型变异，包括C/T182个，A/G166个；另外，450个颠换类型变异中，包括A/T148个，A/C114个，T/G90个和C/G98个；置换型变异位点数量与颠换型变异位点数量比例为1.29∶1。三变异体中包括A/C/G为83个，A/C/T85个，A/G/T76个，T/G/C70个，共计包含置换和颠换两种变异类型。同时，该序列中包含Indel(insertion/deletions)位点8个，总长度为127 bp，其中最大的Indel位点片段长度为19 bp，来源于品种‘J2015-8’，其余均为1~4 bp不等；通过单倍型分析发现，45份杨梅试材中endo-PG基因共存在12种单倍型(Haplotype)。

另一方面，通过与桃endo-PG(GenBank Accession No.DQ659241.1)的同源序列比对发现，有43个(71.7%)单现突变位点发生在预测外显子区域(1 211 bp)，其中，18个突变位点为非同义变异，占单现突变位点总数的30%，其余均为同义变异；此外，预测外显子区域中包含Indel位点8个，Indel位点总长度为92 bp。

2.3 Endo-PG基因遗传进化关系分析

基于Nei遗传距离系数[15]，使用邻接法NJ构建endo-PG基因系统进化树。结果发现45份杨梅试材被划分为4个组(图 2)。“A”组包括15份试材，其中包括著名品种‘荸荠’、‘大浮大叶细蒂’和‘大浮小叶细蒂’等。值得注意的是，其中9份试材均存在等位基因，意味着它们的杂合度相对较高，遗传来源较为复杂。此外，‘J2015-1’和‘J2015-18’为早熟优株，它们与‘荸荠’品种划分于同一分支，意味着它们可能与‘荸荠’品种的亲缘关系比较近；“B”组包括有13份试材，其中包括著名品种‘东魁’等，另外，本组内除‘三夹岙乌梅’外，其余试材均不包含有等位基因，意味着它们的纯合度相对较高。“C”组包含13份试材，其中包括4份来自广东和2份来自湖南的试材，其余的来自江西和浙江。“D”组包含13份试材，其中9份为“A”组中相应试材的等位基因，它们并没有划分于同一个分组内，意味着它们的endo-PG基因具有较高的遗传差异。再者，以上45份试材中有14份(31.1%)包含有等位基因，其中大部分划分于“A”和“D”组，由此可知，它们的杂合度较高且endo-PG基因遗传背景较为复杂。总之，聚类结果与品种遗传来源以及果实硬度具有一定的联系，然而与果实色泽性状的联系不明显。

图 2 基于endo-PG基因采用邻接法(NJ)构建的45份杨梅试材的遗传进化树 Fig. 2 Dendrogram constructed with endo-PG using the neighbor-joining (NJ) clustering method of 45 Chinese bayberry accessions 注：①仅显示部分分支的置信度(>50)；②样品名称后缀字母“A”和“B”代表同一份试材的不同等位基因片段。
3 讨论与结论

本研究采用PCR产物直接测序的方法用于探寻endo-PG基因DNA序列中的SNP位点，该方法方便快捷，节省时间，避免了转化、克隆操作的繁琐步骤；同时，当2个等位基因由于单一位点突变而产生差异时，用1个PCR引物直接进行测序，就能找出杂合位点。但是，为了保证测序结果准确性，需要提供较高浓度的产物且特异性要好，条带单一。此外，由于测序目的片段较长，需设计多条引物用于PCR扩增后测序，并且扩增片段中部分序列需相互重合，这样可使测序结果更加准确。

本研究获得的endo-PG基因部分DNA序列片段长度为1 866 bp，研究结果表明该基因片段的遗传多样性高于桃研究报道的58个SNPs[16]。另外，研究结果表明杨梅endo-PG基因的变异大多来自外显子区域(71.7%)，与相关报道[17, 18, 19]不一致。值得注意的是，其中30%的SNPs为非同义突变，意味着杨梅中endo-PG基因具有更高的遗传多样性，其受到自然选择作用的影响也较强。然而，这些变异位点与果实品质或者其他性状有何联系还有待后续深入研究。此外，本研究结果发现大多数Indel位点长度较短(1~4 bp)，最长的Indel位点为19 bp，仅见于试材‘J2015-8’，可能Indel位点长度越长对植物本身有危害[20]。因此，应该优先考虑选用长度为4~20 bp的Indel位点用于CAPS分子标记的开发，因为小片段的Indel能够便于CAPS(Cleaved amplified polymorphic sequence)分子标记扩增和有助于提高扩增效率。

其次，采用邻接法(NJ)构建基于endo-PG基因的45份杨梅试材遗传进化树的分析表明，果实硬度与聚类结果具有一定的联系；一般来说，“B”组内大部分试材，例如‘东魁’、‘J2015-21’、‘J2015-22’和‘J2015-23’等果实硬度均高于“A”组与“D”组试材，意味着该基因可能在杨梅果实硬度遗传决定机制中具有重要作用。同时，聚类结果与果实色泽性状没有较为明显的联系，意味着杨梅果实色泽性状与endo-PG基因可能没有直接联系。此外，“B”组内除‘三夹岙乌梅’外，其余试材均不包含有等位基因，意味着它们的纯合度相对较高，遗传来源比较简单。因此，在满足科学研究价值的前提下，应尽量优先选用这些纯合度较高的试验材料，以便于降低基因组的复杂程度。再者，“C”组中的‘J2015-8’为晚熟优株，其果实较小且硬度较高(另文发表)，可用于耐贮藏杨梅品种的杂交选育研究，具有较好的开发前景。值得注意的是，该杨梅优株endo-PG基因编码区含有1个19 bp的Indel位点，意味着其可能具有更为复杂的遗传背景，至于是否与果实的硬度品质相关以及是否参与调控果实品质性状还需要后续深入探索研究。

总之，杨梅果实品质相关分子遗传研究基础还十分薄弱，本研究仅初步探索了endo-PG基因部分DNA序列的单核苷酸多态性，今后还需要开展以下几方面研究：(1)开发相应的遗传分子标记用于快速有效地对杨梅进行基因分型分析以及分子标记辅助育种；(2)基因序列多态性与果实品质性状的关联分析；(3)深入探索单核苷酸多态性与基因调控机制的关系。

参考文献
[1] BRUMMELL D A,DAL Cin V,CRISOSTO C H,et al. Cell wall metabolism during maturation, ripening and senescence of peach fruit[J]. J Exp Bot,2004,55(405):2029-2039.(1)
[2] LI X,JIANG J,ZHANG L,et al. Identification of volatile and softening-related genes using digital gene expression profiles in melting peach[J]. Tree Genet Genomes,2015,11(4):1-15.(1)
[3] 薛炳烨,束怀瑞. 多聚半乳糖醛酸酶(PG)与果实成熟软化研究进展[J]. 山东农业大学学报:自然科学版,2002,(2):252-256.(1)
[4] HAYAMA H,ITO A,MORIGUCHI T,et al. Identification of a new expansin gene closely associated with peach fruit softening[J]. Postharvest Biol Tec,2003,29(1):1-10.(1)
[5] TATSUKI M,NAKAJIMA N,FUJII H,et al. Increased levels of IAA are required for system 2 ethylene synthesis causing fruit softening in peach (Prunus persica L. Batsch)[J]. J Exp Bot,2013,64(4):1049-1059.(1)
[6] HAYAMA H,SHIMADA T,FUJII H,et al. Ethylene-regulation of fruit softening and softening-related genes in peach[J]. J Exp Bot,2006,57(15):4071-4077.(1)
[7] 麻国升. 桃果实肉质、粘离核及硬度的关联分析[D]. 北京:中国农业科学院,2012.(1)
[8] JIAO Y,MA R,YU M. Single nucleotide polymorphism analysis of the endopolygalacturonase gene in peach and its potential use in crossbreeding programs[J]. Genet Mol Res,2015,14(2):4090-4101.(1)
[9] BROOKES A J. The essence of SNPs[J]. Gene,1999,234(2):177-186.(1)
[10] 王甲威,林科,姜超,等. 16个高丛越橘品种VcCBF基因的单核苷酸多态性(SNP)分析[J]. 东北农业大学学报,2012,(10):41-44.(1)
[11] MARTÍNEZ-GARCÍA P J,PARFITT D E,OGUNDIWIN E A,et al. High density SNP mapping and QTL analysis for fruit quality characteristics in peach (Prunus persica L.)[J]. Tree Genet Genomes,2013,9(1):19-36.(1)
[12] EMANUELLI F,LORENZI S,GRZESKOWIAK L,et al. Genetic diversity and population structure assessed by SSR and SNP markers in a large germplasm collection of grape[J]. BMC Plant Biol,2013,13(1):39.(1)
[13] EDUARDO I,CHIETERA G,PIRONA R,et al. Genetic dissection of aroma volatile compounds from the essential oil of peach fruit:QTL analysis and identification of candidate genes using dense SNP maps[J]. Tree Genet Genomes,2013,9(1):189-204.(1)
[14] VERDE I,BASSIL N,SCALABRIN S,et al. Development and evaluation of a 9K SNP array for peach by internationally coordinated SNP detection and validation in breeding germplasm[J]. PLoS One,2012,7(4):e35668.(1)
[15] NEI M. Genetic distance between populations[J]. Am Nat,1972:283-292.(1)
[16] MORGUTTI S,NEGRINI N,NOCITO F F,et al. Changes in endopolygalacturonase levels and characterization of a putative endo-PG gene during fruit softening in peach genotypes with nonmelting and melting flesh fruit phenotypes[J]. New Phytol,2006,171(2):315-328.(1)
[17] ZHANG D,YANG X,ZHANG Z,et al. Expression and nucleotide diversity of the poplar COBL gene[J]. Tree Genet Genomes,2010,6(2):331-344.(1)
[18] FU Z,YAN J,ZHENG Y,et al. Nucleotide diversity and molecular evolution of the PSY1 gene in Zea mays compared to some other grass species[J]. Theor Appl Genet,2010,120(4):709-720.(1)
[19] ARANZANA M J,ILLA E,HOWAD W,et al. A first insight into peach[Prunus persica (L.) Batsch]SNP variability[J]. Tree Genet Genomes,2012,8(6):1359-1369.(1)
[20] TENAILLON M I,SAWKINS M C,ANDERSON L K,et al. Patterns of diversity and recombination along chromosome 1 of maize (Zea mays ssp. mays L.)[J]. Genetics,2002,162(3):1401-1413.(1)