研究不同花期小孢子发育的细胞学特点以及小孢子发育时期与花器形态的相关性，可以通过对花器官形态特征的观察来直观判断小孢子的发育状况，选择小孢子培养的最佳接种时期^{[1, 2]}。单倍体育种是植物品种改良的一种常用手段，对君子兰良种繁育意义重大。徐玉冰研究大花君子兰减数分裂过程，观察到细胞质分裂同时型与陆续型并存^[3]。宋雪娇研究了色素万寿菊的小孢子发育与花器官形态相关性，结果表明色素万寿菊小孢子的发育经过了四分体时期、单核期、双核期和三核期4个时期，单核中后期小孢子所占的比例高时的花器官形态为，花蕾长度在2.00~3.49 cm，花蕾纵径与横径之比为2.27~2.44，花药黄色^[4]。关于大花君子兰花期划分及不同花期花朵形态和花粉发育关系的研究未见报道。本研究对君子兰进行花期划分，研究不同花期花朵的外部形态特征和花粉发育情况的对应关系，可以通过花期观察确定君子兰小孢子培养的适合取材时间，为单倍体育种奠定基础。

观察材料均采自吉林农业大学药用植物苗圃温室，选择4年及以上生大花君子兰胜利杂交品种，正常栽培管理。

福尔马林-醋酸-乙醇混合溶液(FAA)固定液^[5]：70%乙醇90 mL；冰乙酸5 mL；福尔马林5 mL。

醋酸-洋红配制：将0.5 g洋红溶解于50 mL的冰醋酸中，充分混合并且煮沸，为了加强染色效果，可以在煮沸的同时向混合溶液中加入1颗螺丝钉。

番红溶液配制：1 g番红溶解于100 mL 50%乙醇中。

固绿溶液配制：0.5 g固绿溶解于100 mL 95%乙醇中。

花蕾形态的观察：从君子兰花莛抽出开始，每天上午选择代表平均发育时期的生长良好的花蕾10个，游标卡尺测量花蕾长度大小和花蕾直径，体式显微镜(XYH-4)下观察花蕾发育情况，并记录与发育时期相应的形态特征。试验3次重复。

花粉发育情况的观察^[6]：同时取花蕾放入卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)中，3 h后取出，常规方法制片，醋酸洋红染色，光学显微镜下观察花粉的发育状况。如不能及时进行染色观察，固定的花蕾转入70%乙醇中，置入4℃冰箱中长期保存。

君子兰总状花序，生于花莛顶端，每一花序着生花朵的数量不等，一般情况下可以达10～20朵，也见单独花序着花到50朵以上。具有膜状总苞片1～2轮，生于花序底部，苞片离生。在君子兰开花初期总苞颜色淡，呈现白色或淡绿色，随着开花期的进行，花期后期逐渐变成膜质，苞片宿存。

君子兰花蕾呈棒槌形，花蕾出现的时颜色一般为黄绿色，随着花蕾的生长颜色逐渐呈现桃红色，随后开放。君子兰的开花顺序通常情况下是顶端中间花蕾最先开放，两端的花蕾成对呼应开花。

君子兰花期较长，从现蕾开始到凋零脱落，可以持续60 d左右。根据君子兰花蕾外部形态特征，将花期分为现蕾期、含蕾期、始开期、盛开期、凋谢期5个时期(表 1)。

表1(Table 1)

表 1 君子兰不同花期的花朵形态特征与花粉发育时期Table 1 Characteristics of blooms and development of pollensduring flowering stages of C.miniata 花期 形态特征 持续时间 /d 花蕾形态/mm 花粉发育阶段 花蕾长 花蕾直径 花被片宽 现蕾期 花莛可见，花序中开始出现花蕾，花蕾嫩黄色到嫩绿色 5 13.72 7.74 7.62 花粉母细胞、二分 体和四分体时期 含蕾期 花冠逐渐生长，颜色由嫩绿逐渐变绿，花被片尖端现桃红色，并且颜色逐渐加深，花被片前端尚密闭 20 24.12 9.58 12.88 单核早期、单核期 始开期 花被片前端开裂，可见雌蕊伸出 9 46.24 13.18 15.56 双核期、成熟花粉 盛开期 花冠的喇叭口开放成平面，花被片全部呈现桃红色 4 47.08 15.72 18.42 成熟花粉 凋谢期 花被片萎蔫、皱缩，颜色变紫褐色，失去光泽，直至脱落 22 42.82 17.22 15.68 成熟花粉

表 1 君子兰不同花期的花朵形态特征与花粉发育时期 Table 1 Characteristics of blooms and development of pollensduring flowering stages of C.miniata

现蕾期花莛刚刚从叶片中抽出，花序上有淡黄或淡绿色花蕾，花蕾大小不等，但是每个花蕾纵径和横径差距较小(图 1-A)，包被于总苞之中，现蕾期一般持续5 d左右，随着花莛完全从叶片中伸出，标志着现蕾期结束。

图 1(Fig. 1)

图 1 大花君子兰的花期划分 Fig. 1 Flowering stages of C.miniata 注：A为现蕾期的花朵；B为含蕾期的花朵；C为始开期的花朵1；D为始开期的花朵2；E为盛开期的花朵；F为凋谢期的花朵。

含蕾期是指花莛和花蕾逐渐发育的生长的过程。在这个过程中花蕾逐渐生长，纵径明显大于横径，含蕾期花蕾颜色逐渐由嫩绿变成绿色，含蕾期后期花被片尖端现桃红色，花被仍旧紧密排列，尖端未见开口(图 1-B)。含蕾期这一过程大致需要20 d左右，花蕾前端开裂，标志这花期由含蕾期进入始开期。

始开期君子兰花蕾前端已经开裂，此时可见雌蕊伸出(图 1-C)，花丝淡黄色，花药乳白色，未有花粉散出。从始开期开始，花被片逐渐松散，花被桃红色的颜色逐渐从尖端开始向下蔓延，花朵开放，花粉散出，雌蕊柱头呈现黄色(图 1-D)，这一过程大于经历9 d左右。

当花冠的喇叭口开放成平面，花被片全部呈现桃红色时君子兰花朵进入盛开期(图 1-E)。盛开期大约持续9 d左右的时间。盛开期持续22 d左右，盛开期过后君子兰花朵进入凋谢期。

凋谢期君子兰花朵逐渐萎蔫，颜色逐渐变暗淡(图 1-F)，最后花被片从子房上脱离。

君子兰花两性，雄蕊6枚。雄蕊是花朵的重要组成部分之一。花粉母细胞在雄蕊花药中产生。花粉母细胞通过减数分裂，最后生成花粉小孢子，小孢子进一步发育，生成成熟花粉粒。君子兰开花的各个时期花蕾形态与花粉发育的关系见表 1。

现蕾期花蕾长13.72 mm，花蕾直径7.74 mm，花被包被紧密，被片淡黄绿色。现蕾期的小孢子处于花粉母细胞时期的二分体和四分体时期。此时期的花粉赤道轴长和极轴长差距不大，花粉基本呈圆形，有较大的细胞核。二分体时期花粉是花粉母细胞经过1次分裂后形成；减数分裂继续进行，2次分裂后形成4个细胞的时期称为四分体时期。

含蕾期花蕾长度增长，花蕾直径增大，花被片宽度增大，花被包被情况较现蕾期松散。含蕾期的小孢子处于单核早期(图 2-A)或者单核期(图 2-C)，单核期的花粉逐渐由球形逐渐变化成椭圆形。随着细胞的扩大，细胞核逐渐由中央位置靠向一侧，细胞进入单核靠边期(图 2-B)。单核靠边期后，小孢子发育进行不均等有丝分裂时期，逐渐进入雄配子体阶段。

图 2(Fig. 2)

图 2 大花君子兰的小孢子发育时期 Fig. 2 Microspore generation period of C.miniata 注： A为单核早期400×；B为单核靠边期400×；C为单核期400×；D为成熟花粉40×；E为成熟花粉200×；F为成熟花粉100×。

始开期花蕾继续增长，被片包被程度疏松，花蕾直径迅速增大，可见柱头从花蕾尖端缝隙中伸出。从该时期开始雄蕊发育进入双核期(图 2-D、F)。

盛开期花蕾长度和直径较始开期小幅度增长，达到最大值，随后逐渐减小，此时期的花粉为成熟花粉并且随着药室隔的打开花药散出。

研究君子兰花器形态特征与小孢子发育进程的关系，可以通过外部形态的观察判断小孢子的发育阶段^{[7, 8, 9]}。君子兰花期60 d左右，根据君子兰花蕾外部形态特征，本研究将花期分为现蕾期、含蕾期、始开期、盛开期、凋谢期5个时期。各时期的花器形态及大小均有较为明显的区别特征；并通过花粉发育过程观察，把花粉发育的各阶段与花器形态特征相对应，为通过花器形态观察直观判断小孢子的发育情况提供了依据。

李守岭研究植物花药培养及影响因素，指出处于单核中期至晚期的小孢子发育时期更适合单倍体培养^[10]。吴丽芳对紫花苜蓿花粉培养研究发现，单核期的紫花苜蓿花粉诱导效果更好^{[11, 12]}。Zagorska等^[13]对紫花苜蓿单倍体培养进行研究，指出适宜花药培养的小孢子同样处于单核期。曹禹等人对于小黑麦单倍体培养研究，发现适宜单倍体培养的时期是单核中、晚期花药^[14]。

因此，小孢子诱导的最佳时期是单核中期至单核靠边期，大花君子兰单核至单核晚期的花蕾处于含蕾期到始开期早期的阶段。在这个时期花被片颜色逐渐由黄绿色转为绿色，尖端可见少量桃红色；花被包裹的紧实度逐渐变得松散，但花冠还未张开。

根据花蕾与花粉发育的相关性可以从花蕾形态上判断君子兰花粉发育的时期，确定君子兰小孢子培养的最佳取样时间。