铁皮石斛Dendrobium Candidum，为兰科石斛属多年生附生草本植物，是我国传统中药材，主要产于四川、云南、广西以及长江流域等地。铁皮石斛的主要药效成分是多糖，具有较强的抗肿瘤、增强免疫功能活性、清胃热、助消化等重要功能。铁皮石斛的自然生长条件十分苛刻，加上长期过度开采，野生资源现已濒临灭绝。目前市场上的绝大部分铁皮石斛是应用植物组织培养技术快速繁殖试管苗并且人工栽培所得，但由于试管苗根系纤弱，移栽后对生长环境要求苛刻，生长周期较长，如果仅靠试管苗移栽的方式是很难满足市场发展的需要，因此寻找一个药效相似的全植株替代药源尤为重要，而采用原球茎大规模液体培养技术，生产中草药细胞是解决铁皮石斛全植株替代药源的最佳途径。

陈晓梅等^[1]研究发现，铁皮石斛原球茎和铁皮石斛的化学成分相似，石斛多糖是二者的共有成分；何铁光等^[2]的研究表明铁皮石斛原球茎多糖含量与野生铁皮石斛的相当；高建平等^[3]的研究发现铁皮石斛原球茎对于机体非特异性免疫功能和细胞免疫功能的调节强度与原药材强度相似。因此，以原球茎作为铁皮石斛全植株的替代药源是可行的。关于铁皮石斛原球茎培养条件，前人进行了较多的研究，但大多集中在基本培养基成分基础上，各种植物激素和有机添加物浓度对铁皮石斛原球茎增殖、生长和多糖积累的影响^{[4, 5, 6]}，关于培养液渗透压对铁皮石斛原球茎生长及多糖合成影响的研究还鲜有报道。

本试验以甘露醇作为铁皮石斛液体培养基的渗透压调节剂，研究不同浓度的甘露醇对铁皮石斛原球茎生长及多糖合成的影响，旨在为铁皮石斛原球茎大规模液体培养生产铁皮石斛药源及多糖提供理论参考。

试验材料为铁皮石斛种子经无菌播种得到的原球茎，由河池学院微生物及植物资源开发利用实验室提供。

以1/2MS+0.1 mg·L^-1NAA+30 g·L^-1蔗糖为基础培养基，按甘露醇质量浓度为0(CK)、10、20、30、40 g·L^-1分别添加于液体培养基中以调节渗透压，并形成5个不同的处理，分别以10、20、30、40、50 g·L^-1表示各处理。将无菌原球茎按2.0～2.5 g的接种量分别接种在装有30 mL培养基的100 mL三角瓶中，每处理接种90瓶，于温度(25±2)℃，光强1 500～2 000 lx，摇床转速为110 r·min^-1的条件下进行培养。

于培养后15、25、35、45 d每处理取15瓶，并分别测定各处理原球茎活力、鲜重、干重、多糖含量和多糖产量。

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定原球茎活力，并以四氮唑还原强度[mg·(g.h)^-1]表示。

原球茎鲜重和干重测定：将铁皮石斛原球茎与培养液过滤分离，再将原球茎置于三角瓶中，用自来水冲洗后过滤，反复冲洗5次，用吸水纸吸干原球茎表面上的水，称重即得鲜重，将原球茎在105℃烘30 min后调至60℃烘24 h，称得原球茎干重。分别按下式计算原球茎鲜重和干重，即

多糖含量和多糖产量测定：用热水浸提法提取原球茎多糖，即准确称取铁皮石斛原球茎干品粗粉1.000 mg用滤纸和脱脂纱布包好，先经石油醚(60~90℃)在索氏提取器中于85℃的水浴中回流脱脂1.5 h，再用80%乙醇在95℃水浴中回流3 h，取出滤纸包置于105℃烘干箱中烘干(约30 min)。把药渣和滤纸包一起置于150 mL的三角瓶中，加入蒸馏水50 mL，于80℃水浴提取3 h，趁热过滤100 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀，即得铁皮石斛原球茎多糖溶液。多糖含量用改良的苯酚—浓硫酸的方法进行测定，即精密吸取样品液2.5 mL于25 mL容量瓶中，定容、摇匀，取1 mL置于试管中，加蒸馏水补足至2.0 mL，加苯酚试剂1.0 mL混匀，迅速滴加浓硫酸5.0 mL，并迅速混匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min后，取出，流水冷却，然后在490 nm处测定吸光度。分别按下式计算多糖含量和多糖产量，即

式中，C为样品溶液中葡萄糖的浓度(μg·mL^-1)，D为样品溶液的稀释倍数，V为样品溶液的体积(mL)，F为换算因子，W为样品的质量(g)。

采用Excel 2003和SPSS 19.0软件进行数据处理和统计分析。

从图 1可以看出，不同甘露醇浓度处理的铁皮石斛原球茎活力在培养后15～25 d时呈上升趋势；培养后25 d各处理分别达到最大值，其中20 g·L^-1的处理原球茎活力最强，为196.46 mg·g^-1·h^-1，其次是10 g·L^-1的处理，为184.92 mg·g^-1·h^-1，40 g·L^-1的处理原球茎活力最弱。培养后25～45 d各处理原球茎活力逐渐下降。此外，在不同的培养时间，不处理原球茎活力均有较大差异。当甘露醇质量浓度为0～20 g·L^-1时，随着甘露醇质量浓度的增加，原球茎活力逐渐增强，当甘露醇质量浓度超过20 g·L^-1，原球茎活力呈下降趋势，且在整个培养周期中40 g·L^-1处理原球茎活力均低于对照，而40 g·L^-1除了在培养后15 d外其他培养时间均高于对照，说明适当添加甘露醇，调节培养液渗透压，有利于增强铁皮石斛原球茎活力，但当甘露醇浓度过高时对原球茎活力可能产生抑制作用。

图 1(Fig. 1)

图 1 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎活力变化 Fig. 1 Vigor of protocormsin medium with various mannitol concentrations 注：图中不同大小写字母表示差异显著(P<0.05)和差异极显著(P<0.01)。下图同。

方差分析表明，除了培养后15 d，各处理原球茎活力与对照差异极显著。此外，在培养后15 d，甘露醇质量浓度为10 、20和30 g·L^-1的处理原球茎活力两两间差异不显著，三者与40 g·L^-1的处理和对照间的差异极显著，40 g·L^-1处理与对照间的差异不显著；在培养后25 d，甘露醇浓度为20、30和40 g·L^-1的处理两两间差异极显著，三者与10 g·L^-1的处理和对照间的差异极显著，10 g·L^-1的处理和对照间的差异不显著；在培养后35 d，10、20和40 g·L^-1的处理两两间差异极显著，且与对照间差异极显著，30 g·L^-1的处理与对照差异不显著，30与40 g·L^-1处理间差异显著，但与甘露醇浓度为20、30和40 g·L^-1的处理差异极显著；在培养后45 d，20、30和40 g·L^-1的处理两两间差异极显著，且与对照和10 g·L^-1的处理间差异极显著，10 g·L^-1的处理与对照间差异显著。

由图 2可知，培养后15～35 d各处理原球茎鲜重呈上升趋势，且在培养后35 d达最大值，培养后45 d原球茎鲜重降低。在整个培养期，10和20 g·L^-1处理的原球茎鲜重均高于对照，40 g·L^-1的处理原球茎鲜重均比对照低；培养后25～45 d，甘露醇浓度为30 g·L^-1的处理原球茎鲜重均低于对照。在不同的培养时间，当甘露醇浓度为0～20 g·L^-1时，随着甘露醇浓度的增加，原球茎鲜重逐渐增强，当甘露醇浓度超过20 g·L^-1，原球茎鲜重呈下降趋势，说明在一定范围内增加甘露醇浓度，可促进铁皮石斛原球的生长，但高渗透压的培养液对铁皮石斛原球的生长具有较明显的抑制作用。

图 2(Fig. 2)

图 2 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎的鲜重动态变化 Fig. 2 Fresh weight of protocormsin medium with various mannitol concentrations

方差分析表明，培养后15 d，各处理与对照间的差异极显著，20和30 g·L^-1的处理间差异不显著，二者与10、40 g·L^-1的处理间差异极显著，10与40 g·L^-1的处理间差异极显著；培养后25 d，20 g·L^-1的处理与对照、30和40 g·L^-1的处理间差异极显著，与10 g·L^-1的处理间差异不显著，10 g·L^-1处理与对照差异不显著，30与40 g·L^-1处理间差异极显著，且二者对照间差异分别为显著和极显著；培养后35和45 d，除10 g·L^-1处理外，其他各处理之间差异均极显著。

图 3表明，培养后35 d，各处理的干重达最大值。培养后15～45 d，40 g·L^-1的处理原球茎干重均为最低且低于对照，而30 g·L^-1的处理除了培养后15 d干重高于对照外，其他各培养时间其干重低于对照。说明高浓度的甘露醇，不仅抑制原球茎的生长，对原球茎干物质的积累也有抑制作用。

图 3(Fig. 3)

图 3 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎干重动态变化 Fig. 3 Dry weight of protocormsin medium with various mannitol concentrations

方差分析表明，培养后15 d，20和30 g·L^-1的处理与对照间的差异极显著，10和40 g·L^-1的处理与对照间差异不显著；培养后25 d，40 g·L^-1的处理与对照和其他处理差间异极显著，10 、20和30 g·L^-1的处理差与对照间异不显著；培养后35 d，20 g·L^-1的处理与对照和其他处理间差异均极显著，10 g·L^-1的处理差与对照间异不显著，30和40 g·L^-1的处理差与对照间异显著；培养后45 d，20 g·L^-1的处理与对照和10 g·L^-1处理间差异不显著，与30和40 g·L^-1的处理与对照间差异极显著。

由图 4可知，从培养后15～35 d，各处理的多糖含量均呈上升趋势；培养后35～45 d，呈下降趋势；培养后35 d，各处理的多糖含量均达最大值，其中10 g·L^-1的处理为317.38 mg·g、20 g·L^-1的处理为361.52 mg·g^-1、30 g·L^-1的处理为230.95 mg·g^-1、40 g·L^-1的处理为204.61 mg·g^-1、对照为276.89 mg·g^-1，且各处理间的差异极显著。在不同的培养时间，20 g·L^-1的处理多糖含量均为最高，且与对照和其他处理的差异都达极显著水平。此外，当甘露醇质量浓度为0～20 g·L^-1时，随着甘露醇质量浓度的增加，原球茎多糖含量逐渐提高，当甘露醇质量浓度超过20 g·L^-1，多糖含量呈下降趋势，说明甘露醇拨云见日一浓度较低时，可促进铁皮石斛原茎球多糖的积累，而高浓度的甘露醇对铁皮石斛原球茎多糖的积累具有较明显的抑制作用。

图 4(Fig. 4)

图 4 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎多糖含量的动态变化 Fig. 4 Polysaccharide content of protocormsin medium with various mannitol concentrations

图 5表明，各处理多糖产量的变化趋势与多糖含量的变化一致，即从培养后15～35 d，各处理的多糖产量均呈上升趋势；培养后35～45 d，各处理的多糖产量均呈下降趋势；培养后35 d，各处理的多糖产量均达最大值，分别为4 080.60、4 713.09、6 255.38、2 972.33和2 647.96 mg·L^-1。在不同的培养时间，20 g·L^-1处理多糖产量均高于其他处理，且与对照和其他处理间的差异均极显著，而40 g·L^-1处理多糖产量均最低，但其与对照间的差异均极显著；培养后15 d和25 d，10、30和40 g·L^-1处理两两间的差异均极显著；培养后35和45 d，30和40 g·L^-1处理间的差异显著，二者与10 g·L^-1处理间的差异极显著。

图 5(Fig. 5)

图 5 不同甘露醇质量浓度处理铁皮石斛原球茎的多糖产量变化 Fig. 5 Polysaccharide yield of protocorm in medium with various mannitol concentrations

随着野生铁皮石斛的过度开采及市场上的大量需求，利用组织培养技术进行原球茎的快速繁殖被认为是解决铁皮石斛药源的有效途径。在铁皮石斛原球茎的培养过程中，其生长量、干物质积累量、多糖含量和多糖产量等常作为培养质量的评价指标，铁皮石斛原球茎的生长及其多糖的积累受到培养方式、植物生长调节剂、培养基渗透压等诸多因素的影响。苏江等^[7]研究表明，在培养第20 d添加5 g·L^-1蔗糖有利于铁皮石斛原球茎干物质形成和多糖积累，多糖含量和多糖产量分别为300、4 805.85 mg·L^-1；研究还发现以植物生长调节剂配比NAA0.6 mg·L^-1+BA0.5 mg·L^-1+KT1.5 mg·L^-1最有利于原球茎干物质形成，NAA0.4 mg·L^-1+BA0 mg·L^-1+KT1.5 mg·L^-1是促进原球茎多糖合成的植物生长调节剂配比最佳组合；摇床转速120 r·min^-1，初始pH 6.0，接种量90 g·L^-1是有利于铁皮石斛原球茎的干物质形成和多糖合成的最佳组合。何铁光等^[8]等研究发现，相对于乳糖和果糖，蔗糖和葡萄糖对原球茎生长和多糖积累更有利，且发现蔗糖起始浓度为30 g·L^-1有利于原球茎生长，在培养40 d时其多糖最高含量为208.7 mg·g^-1,多糖产量为3 679.6 mg·L^-1。

甘露醇是一种蔗糖乙醇，与蔗糖分子结构相似，但在植物代谢中不活泼，不能被植物吸收作为碳源。在植物组织培养中常通过添加甘露醇来调节培养基渗透压，造成培养基水势降低，阻碍培养物对水分和养分的吸收，同时减少营养物质的消耗。目前，在植物组织培养中甘露醇主要用于种质的资源保存和生长调节等^{[9, 10, 11, 12]}。收获多糖是铁皮石斛原球茎培养的主要目标，而原球茎的生长决定了多糖积累量和产量。本研究表明，于培养液中添加不同浓度的甘露醇形成的不同渗透压对铁皮石斛原球茎的生长及其多糖的积累均有明显的影响。当甘露醇质量浓度为0～20 g·L^-1时，随着甘露醇浓度的增加，原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量总体呈上升趋势，当甘露醇质量浓度超过20 g·L^-1，原球茎活力、生长量、多糖含量和多糖产量呈下降趋势，说明甘露醇浓度较低时，可促进铁皮石斛原球茎生长和多糖的积累，高浓度的甘露醇对铁皮石斛原球茎生长和多糖的积累具有较明显的抑制作用，且随着培养时间的延长其抑制作用亦加明显。笔者认为，这可能是由于培养液中添加低浓度的甘露醇后形成一定的渗透压，更有利于原球茎对水分和养分的吸收，同时提高了原球茎细胞内与代谢相关酶的生理活性及效应，从而促进原球茎的生长和多糖的积累；而高浓度的甘露醇添加于培养液后其渗透压大幅上升，对原球茎形成水分逆境，阻碍原球茎对水分和养分的吸收，原球茎细胞内酶的活性减弱，从而使原球茎的生长和多糖积累受到明显的抑制。

本研究于培养液中分别添加0、10、20、30、40 g·L^-1的甘露醇，旨在探讨不同培养液参透压对铁皮石斛原球茎的生长和多糖积累的影响，从考核的指标来看，添加甘露醇质量浓度为10～20 g·L^-1可促进原球茎的生长和多糖积累，其原球茎活力、鲜重、干重、多糖含量和多糖产量都高于对照，而添加甘露醇质量浓度为30～40 g·L^-1的处理原球茎活力、鲜重、干重、多糖含量和多糖产量都比对照低。因此，生产中可考虑在培养液中添加低浓度的甘露醇以调节合适的渗透压。此外，在培养后35 d，各处理的原球茎干重、多糖含量和多糖产量均达最大值，且甘露醇质量浓度为20 g·L^-1的处理其干重、多糖含量和多糖产量均高于对照和其他处理，分别为17.30 g·L^-1、361.52 mg·g^-1和6 255.38 mg·L^-1，比前人的研究结果稍高。

本研究首次探讨了不同浓度的甘露醇作为渗透压调节剂对铁皮石斛原球茎的生长和多糖积累的影响，研究结果对大规模生铁皮石斛原球茎获取铁皮石斛多糖具有一定的参考价值。