中国是农业大国，也是秸秆资源最丰富的国家之一^[1]。据报道我国平均年产秸秆量达到6亿～7亿t，占世界秸秆总产量的20%～30%，是生物质能源十分重要的组成部分^{[2, 3, 4, 5]}。其中，年产玉米秸秆量可达2.2 亿t^[6]。玉米秸秆中含有大量高分子难分解的纤维素、木质素、半纤维素等物质^[7]，目前，玉米秸秆中有一小部分被用作饲料，大部分都被烧毁或弃置农田，这不但对资源造成了极度的浪费，而且也对环境造成了严重的污染^{[8, 9]}。近年来，秸秆的合理利用不得不引起了人们的广泛关注，已成为保持农业可持续发展的及其重要的组成部分^{[10, 11]}。

由于秸秆化学结构复杂，具有很强的抗分解能力。而单一的微生物不能产生所有分解其高分子物质的酶，因此一种微生物对其高分子物质的分解能力是有限的，对秸秆进行降解需要多种微生物的协同作用^{[12, 13, 14, 15]}。目前，在微生物腐熟菌剂的研究方面，越来越多的学者将获得的一些纯培养菌株进行优化组，然后制成微生物复合菌剂使用，取得了良好的降解效果^{[16, 17]}。

白腐真菌是一种对木质素有很强降解能力的菌株，但是对于纤维素的降解效果却不是很理想^{[18, 19]}，菌株S-3是从玉米秸秆上筛选出的1株能有效降解纤维素的菌株。本研究以农业废弃物玉米秸秆为基质，探讨白腐菌和菌株S-3的最佳复合降解条件，使农作物秸秆得到最大程度的降解，有效地利用和转化秸秆资源，扩大发酵产品工业原料来源，降低发酵产物成本。

S-3菌株(mL)：筛选自玉米秸秆； 白腐真菌(g) ：购于中国工业微生物菌种保藏中心；玉米秸秆：采自贵阳市郊农田，烘干、粉碎，过40目筛； 酱油渣：贵阳市味莼园食品有限公司提供。烘干，过40目筛。

琼脂、七水硫酸镁、磷酸氢二钾、维生素B₁ 、无水磷酸氢二钠、硼酸钠、十二烷基硫酸钠、乙二醇乙醚、乙二胺四乙酸二钠，均为分析纯试剂； 基础培养液(L)：KH₂PO₄，2.0 g；MgSO₄·7H₂O，5.0 g；CaCl₂·2H₂O，0.094 g；V_B1，100 mg；微量元素混合液，70 mL；微量元素混合液(L^-1)：氨基酸，0.5 g；MgSO₄·7H₂O，3.0 g；NaCl，11 g；FeSO₄·7H₂O，0.1 g；CoSO₄，0.1 g；CaCl₂·2H₂O，0.1 g；ZnSO₄·7H₂O，0.19 g；CuSO₄·5H₂O，0.01 g；AlK(SO₄)₂·12H₂O，0.01 g；H₂BO₃，0.01 g；Na₂MoO₄·2H₂O，0.01 g； MnSO₄·H₂O，0.01 g。

YX280B手提式灭菌锅(上海三申医疗器械有限公司)；2 000 W电子万用炉(天津市泰斯特仪器有限公司)；LS-1F型 净化工作台(上海索谱仪器有限公司)；分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；SPX-150C型 恒温恒湿培养箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；SHZ-D(Ⅲ) 循环水式真空泵(巩义市英予华仪器厂)；G₃号 砂芯坩埚 (上海良平仪器仪表有限公司)；碘瓶(上海良平仪器仪表有限公司)；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ烘箱(上海索普仪器有限公司)；样品筛(北京三合永道)。

(1)S-3菌株种子培养液的制备：称取200 g去皮切丁的新鲜马铃薯加入1 000 mL水加热煮沸，持续20 min，后用4层纱布过滤2~3次，加水补足至1 000 mL，加入20 g葡萄糖，3 g KH₂PO₄，1.5 g MgSO₄·7H₂O，微量维生素B₁，搅拌溶解，冷却。分别分装在250 mL三角瓶中，灭菌(121℃，30 min)，冷却。接种，30℃，恒温恒湿培养3 d，即为S-3菌株种子培养液； (2)发酵培养基的制备：5 g玉米秸秆粉和5 g酱油渣于250 mL的三角瓶中，加一定量的水，搅拌均匀，灭菌冷却后，接入一定量的S-3菌种子液，在一定的温度下培养，测定纤维素和木质素含量； (3)白腐真菌种子培养液的制备：称取200 g去皮切丁的新鲜马铃薯加入1 000 mL水加热煮沸，持续20 min，后用4层纱布过滤2~3次，加水补足至1 000 mL，加入20 g葡萄糖，15 g琼脂，3 g KH₂PO₄，1.5 g MgSO₄·7H₂O，微量维生素B₁，搅拌溶解，冷却。分别分装在250 mL三角瓶中，灭菌(121℃，30 min)，倒平板，冷却。接种白腐菌，30℃，恒温恒湿培养3 d，即为白腐菌种子培养液； (4)发酵培养基的制备：玉米秸秆5 g，酱油渣4 g，吐温50 mg，加入一定量的基础培养液，搅拌混匀。

中性洗涤纤维测定：准确称取1 g样品置于100 mL 碘瓶中，加入70 mL中性洗涤剂，之后放入已沸的高压锅，100℃保温40 min,115～121℃保温20 min,煮沸完毕后，取下碘瓶，将溶液倒入安装在抽滤瓶上的已知重量的玻璃坩埚中进行过滤，将碘瓶中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直洗至滤液呈中性为止，依次用95%乙醇、无水乙醇和丙酮洗涤2次，抽滤，将残渣置真空干燥器中，干燥20 min，称至恒重。

酸性洗涤纤维测定：准确称取1 g样品置于碘瓶中，加入70 mL酸性洗涤剂，之后放入已沸的高压锅，100℃保温50 min，煮沸完毕后，趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。将玻璃坩埚置于80℃烘箱中烘2 h后，在干燥器中冷却30 min称重，直称至恒重。

酸性洗涤木质素和酸不溶灰分测定：将酸性洗涤纤维加入72%硫酸，在20℃消化3 h后过滤，并冲洗至中性。消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。

中性洗涤纤维含量的计算：

NDF/%=[(W₁-W₂)/ W]×100%

式中：W₁为玻璃坩埚和NDF重(g)； W₂为玻璃坩埚重(g)；W为试样重(g)。

酸性洗涤纤维含量的计算：

ADF/%=[(G₁-G₂)/G]×100%

式中：G₁为玻璃坩埚和ADF重(g)；G₂为玻璃坩埚重(g)；W为试样重(g)

纤维素含量的计算：

纤维素/%=ADF-经72%硫酸处理后的残渣

木质素含量的计算：

ADL/%=残渣-灰分

降解率/%=[(降解后含量-初始含量)/初始含量]×100%

(1)不同S-3菌株与白腐真菌复合配方对玉米秸秆降解效果： 玉米秸秆5 g，酱油渣4 g，Tween 80用量为50 mg，料水比1∶2.5，搅拌混匀后，分别接入如表 1所示的S-3菌株与白腐真菌的用量，在30℃条件下培养，发酵14 d后测定发酵培养基中的木质素和纤维素的含量； (2)不同发酵时间对玉米秸秆降解效果： 玉米秸秆5 g，酱油渣4 g，Tween 80用量为50 mg，料水比1∶2.5，搅拌混匀后，S-3菌株与白腐真菌的复合配方为8∶8，在30℃条件下培养，分别发酵5、8、11、14、17、21 d后测定发酵培养基中的木质素和纤维素的含量； (3)不同发酵温度对玉米秸秆降解效果： 玉米秸秆5 g，酱油渣4 g，Tween 80用量为50 mg，料水比1∶2.5，搅拌混匀后，S-3菌株与白腐真菌的复合配方为8∶8，分别在26、28、30、32、34、36℃条件下培养，发酵14 d后测定发酵培养基中的木质素和纤维素的含量； (4)不同料水比对玉米秸秆降解效果： 玉米秸秆5 g，酱油渣4 g，Tween 80用量为50 mg，料水比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5，搅拌混匀后，S-3菌株与白腐真菌的复合配方为8∶8，在31℃条件下培养，发酵14 d后测定发酵培养基中的木质素和纤维素的含量。

表1(Table 1)

表 1 S-3菌株与白腐真菌用量Table 1 Dosage of S-3/white rot fungi mixture for fermentation 序号 S-3菌株用量/mL 白腐真菌用量/g 1 2 14 2 4 12 3 6 10 4 8 8 5 10 6 6 12 4

表 1 S-3菌株与白腐真菌用量 Table 1 Dosage of S-3/white rot fungi mixture for fermentation

在单因素实验的基础上，以S-3菌株与白腐真菌的复合配方、发酵时间、发酵温度和料水比4个因素，选择L9(3⁴)进行正交试验设计，设计水平与因素见表 2。

表2(Table 2)

表 2 正交试验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment 因素水平 S-3菌株∶白腐菌/ [V(mL)∶m(g)] 发酵时间/d 发酵温度/℃ 料水比 水平1 6∶10 11 30 1∶2 水平2 8∶8 14 32 1∶2.5 水平3 10∶6 17 34 1∶3

表 2 正交试验因素水平 Table 2 Factors and levels of orthogonal experiment

采用 Excel 和 SPSS 22.0对数据进行统计分析，采用Duncan法进行多重比较。

由图 1可知，随着复合菌剂中S-3菌株比例增加，复合菌剂降解纤维素的能力不断增强，同时，纤维素占发酵干基的比率也在不断下降。当S-3菌株和白腐菌的用量从2 mL和14 g变化到10 mL和6 g时，纤维素下降的速率非常迅速；当S-3菌株和白腐菌的用量从10 mL和6 g变化到12 mL和4 g时，纤维素下降的速率趋于缓慢。因此，复合菌剂的配方是S-3菌株∶白腐菌=10∶6，此时纤维占发酵干基的比率由最初的35.48%降到23.32%，降解率为34.27%。

图1(Figure 1)

图 1 不同白腐真菌与S-3菌株复合配方对降解玉米秸秆效果 注：不同小写字母表示差异显著，图2~4同。 Fig. 1 Effect of combination ratio of white rot fungi and S-3 on degradation of cornstalks

随着复合菌剂中白腐菌用量的增加，复合菌剂降解木质素的能力也在不断增强。从整个曲线的变化趋势看，选择S-3菌株∶白腐菌=6∶10为降解木质素的最佳菌剂配比，此时木质素占发酵干基的比率由最初的15.37%降到9.73%，降解率为36.69%。

综合纤维素和木质素的最佳降解菌剂配比，选择S-3菌株与白腐菌用量配方为8 mL∶8 g,此时纤维素和木质素占发酵干基的比率分别为23.87%和10.04%，降解率分别为32.72%和34.68%。

由图 2可知，随着发酵时间的延长，纤维素和木质素占发酵干基的比率不断下降。当发酵时间为21 d时，纤维素和木质素占发酵干基的比率最小，分别为22.83%和9.65%，降解率分别为35.65%和37.22%。从经济上考虑，复合菌剂的最佳降解时间选取纤维素和木质素下降速率逐渐平缓的点，即14 d为宜，此时纤维素和木质素占发酵干基的比率分别为23.22%和9.76%，降解率分别为34.55%和36.50%。

图2(Figure 2)

图 2 不同发酵时间对降解玉米秸秆效果影响 Fig. 2 Effect of fermentation duration on degradation of cornstalks

当温度从26℃升至32℃时，纤维素占发酵干基的比率逐渐下降；当温度从32℃升至36℃时，复合菌剂降解纤维素的能力又在不断下降，因此选择32℃为复合菌剂降解纤维素的最佳发酵温度，在此条件下纤维素占发酵干基的比率从最初的35.48%降为23.14%，降解率为34.78%(图 3)。

图3(Figure 3)

图 3 不同发酵温度对降解玉米秸秆效果影响 Fig. 3 Effect of fermentation temperature on degradation of cornstalks

发酵温度对复合菌剂降解木质素的能力也有一定的影响，复合菌剂降解木质素的最佳发酵温度是30℃，在此条件下木质素占发酵干基的比率由最初的15.37%降为9.72%，降解率为36.76%。综合纤维素和木质素的最佳降解温度，选择32℃为最佳的降解温度。

由图 4可知，料水比由1∶1增加到1∶2.5，纤维素素和木质素占发酵干基的比率不断下降，表明复合菌剂降解玉米秸秆的能力在不断的增强；当料水比由1∶2.5增加到1∶3.5时，复合菌剂降解秸秆的能力又有所下降，这可能与培养基中的O₂含量多少有关。因此选择1∶2.5为降解玉米秸秆的最佳料水比，在此条件下纤维素和木质素占发酵干基的比率分别为23.31%和9.68%，降解率分别为34.30%和37.02%。

图4(Figure 4)

图 4 不同料水比对降解玉米秸秆效果影响 Fig. 4 Effect of ratio of cornstalks to water on degradation of cornstalks

由表 3中纤维素的R值可知，S-3菌株与白腐真菌复合配方对复合菌剂降解纤维素的影响最大，其次是发酵时间。由正交试验得出复合菌剂降解纤维素的最佳的实验组合是：A₂B₃C₁D₂，即S-3菌株∶白腐真菌=8∶8，发酵时间为17 d，发酵温度为30℃，料水比为1∶2.5，在此条件下纤维素占发酵干基的比率由最初的35.48%降为22.85%，降解率为35.60%。由表 4对纤维素的方差分析可知，S-3菌株与白腐真菌复合配方和发酵时间对复合菌剂降解纤维素的影响达到显著水平。

表3(Table 3)

表 3 正交试验结果分析Table 3 Results of orthogonal test 试验号 A S-3菌株∶白腐真菌/[V(mL)∶m(g)] B发酵时间/d C发酵温度/℃ D料水比 纤维素 木质素 1 1 1 1 1 25.32 10.12 2 1 2 2 2 24.82 9.84 3 1 3 3 3 24.13 10.03 4 2 1 2 3 24.17 10.24 5 2 2 3 1 23.97 10.05 6 2 3 1 2 22.85 9.62 7 3 1 3 2 25.42 10.21 8 3 2 1 3 24.83 10.08 9 3 3 2 1 24.37 9.93 木质素 均值1 24.757 24.970 24.333 24.553 均值2 23.663 24.540 24.453 24.363 均值3 24.873 23. 783 24.507 24.377 极差R 1.210 1.187 0.174 0.910 较优水平 A2 B3 C1 D2 因素主次 A＞B＞D＞C 纤维素 均值1 9.997 10.190 9.940 10.003 均值2 9.970 9.990 10.003 9. 890 均值3 10.073 9.860 10.097 10.117 极差R 0.103 0.330 0.157 0.227 较优水平 A2 B3 C1 D2 因素主次 B＞D＞C＞A

表 3 正交试验结果分析 Table 3 Results of orthogonal test

表4(Table 4)

表 4 正交试验方差分析Table 4 Variance analysis for orthogonal test results 因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 木质素 S-3菌株∶白腐真菌 2.673 2 39.896 9.000 * 发酵时间 2.166 2 32.328 9.000 * 发酵温度 0.047 2 0.701 9.000 料水比 0.067 2 1.000 9.000 误差 0.07 2 纤维素 S-3菌株∶白腐真菌 0.017 2 1.000 9.000 发酵时间 0.166 2 9.765 9.000 * 发酵温度 0.037 2 2.176 9.000 料水比 0.079 2 4.647 9.000 误差 0.02 2

表 4 正交试验方差分析 Table 4 Variance analysis for orthogonal test results

由表 3中木质素的R值可知，发酵时间对复合菌剂降解木质素的影响最大，其次是发酵温度，最佳降解木质素的实验方案为A₂B₃C₁D₂， 即S-3菌株与白腐真菌复合配方为8∶8，发酵时间为17 d，发酵温度为30℃，料水比为1∶2.5，在此条件下木质素占发酵干基的比率由最初的15.37%降为9.62%，降解率为37.41%。由表 4中对木质素的方差分析可知，发酵时间对复合菌剂降解木质素的影响达到显著水平。

秸秆主要是由纤维素、半纤维素和木质素等成分组成，其化学结构非常复杂，并且具有很强的抗分解能力。而单一的微生物不能产生所有分解纤维素的酶，因此一种微生物对其高分子物质的分解能力是有限的，对秸秆进行分解需要多种微生物的协同作用。因此，混合菌的作用越来越受到重视^{[20, 21, 22]}。大量研究表明，各菌种对环境的要求苛刻以及菌种间产生相互依赖、相互协同的作用等原因，使大部分微生物无法通过实验室分离培养方法获得，得到的只是极小部分微生物，很不全面，分泌的酶系较单一，并且使用效果有限^[23]。因此在微生物腐熟菌剂的研究方面，越来越多的学者将获得的一些纯培养菌株进行优化组合，然后制成微生物复合菌剂使用，取得了良好的堆肥腐解效果。笔者进行复合菌剂对玉米秸秆生物降解作用的研究，为复合菌剂的进一步发展提供了依据，并开发出能用于农业生产的微生物复合菌剂，最终解决了由于秸秆焚烧和废弃等产生的环境危害问题。

目前，国内外对于秸秆高效腐熟菌剂的研究己有较大进展。邱向阳、黄得扬等^{[24, 25]}对在秸秆堆肥体系中筛选出的高效纤维素降解菌群进行了研究，并构建了用于花卉秸秆高效堆肥的复合降解微生物菌剂；王伟东等^[26]以麦秸垛下的土壤和麦秸堆肥为材料，利用限制性培养技术，经过多代淘汰及其不同系之间的组配，最终筛选构建了一组木质纤维素分解菌复合系；Haruta等^[27]筛选的高效稳定的纤维素分解菌群，这些菌株组合的纤维素分解能力明显优于单株菌。笔者进行了复合菌剂对玉米秸秆生物降解作用的研究，为复合菌剂剂的进一步发展提供依据，并开发出能用于农业生产的微生物复合菌剂，最终解决由于稻秆焚烧和废弃等产生的危害。

本研究只选取了玉米秸秆作为被降解的对象，酱油渣为辅料。在今后的研究中，还可以选取其他的农作物秸秆作为发酵底物或其他企业下脚料如，酒糟、醋糟、药渣等作为发酵的辅料，进行深入研究。做到实现利用农作物秸秆的最大程度化，减少资源的浪费；本研究中从玉米秸秆中分离筛选出的S-3菌株，对农作物秸秆的降解具有很强的降解能力，如果能从其降解机理、代谢规律等方面做更加深层次的研究，通过基因突变选育出优良的S-3菌株变种，S-3菌株将会发挥其更大降解纤维素的能力。

本试验研制出由S-3菌株和白腐真菌复合而成的复合菌剂，能够有效地降解玉米秸秆中的纤维素和木质素，充分利用两种菌株的降解优势，达到同时降解玉米秸秆的目的；由单因素和正交试验得出降解玉米秸秆的最佳条件为：S-3菌株与白腐真菌的复合配方为8∶8，发酵时间为17 d，发酵温度为30℃，料水比为1∶2.5，在此条件下，秸秆纤维素的降解率为：35.60%，木质素的降解率为：37.41%。