2016, Vol. 31
2. 福建农林大学, 福建 福州 350108
2. Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350108, China
发酵床养猪是将微生物发酵技术和养殖技术相结合，利用垫料吸收养殖过程中排泄的猪粪尿，通过微生物进行原位发酵，分解消纳，去污除臭，实现了畜禽养殖的清洁环保[1]。生猪排泄的粪尿和发酵床垫料充分混合，发酵分解过程实质上是微生物的物质代谢和能量转化过程，因此微生物群落组成与空间分布的研究是揭示发酵床垫料中微生物多样性产生和维持机制的必要前提，对及时了解发酵进程、有效控制发酵过程、优化发酵条件、提高粪污降解效率都具有很重要的作用。在粪便腐熟发酵过程中，无论是常温型还是高温型，细菌的数量占了绝对的优势，升温期各种微生物数量均有增加。进入高温期只有高温细菌和高温放线菌的数量继续上升，在腐熟期细菌数量下降，但放线菌和霉菌数量明显上升[2]。刘波等[3-4]运用脂肪酸生物标记法研究了零排放猪舍基质垫层微生物群落的多样性，并提出了微生物群落分布的特征指标，构建发酵指数指示基质垫层的发酵特性。毕泗伟等[5]采用16S rDNA 基因文库技术分析发酵床细菌群落，结果表明，各层垫料细菌均分布在数十个已知细菌种属里，中层和深层垫料中具有明显的与分解氮等有机物相关的优势菌株。养猪发酵床垫料的微生物组成种类较多,呈现出很高的微生物多样性。在同一个猪舍内，其管理方式较为一致，养殖环境基本相同，但各饲养栏内猪只的生长状况、生活习惯等均存在差异，会造成垫料中微生物优势种类，种群结构等也存在差异。本研究采集相同猪舍内不同饲养栏内的发酵床垫料，采用平板分离方法，分析研究垫料中细菌、真菌和放线菌的多态性，不同类群微生物的分布状态，从微生态角度进一步阐明发酵床垫料中微生物的变化动态。研究结果将进一步丰富微生物发酵床养殖技术理论体系，也为该项技术的实际应用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 采样环境采样地点为福州新店养猪场，饲养“杜×长×大”商品猪，采用接触式微生物发酵床饲养模式[1]。本研究样品采集自饲养第2批生猪起取样，取样期间室外气温为26~38℃，猪舍采用风机配合水帘降温，舍内温度27~32℃。
1.2 样品采集样点位置分布见图 1。每个猪栏发酵床面积为6 m×8 m=48 m2，基质垫层厚度80 cm，主要配料为谷壳和锯末，基本配比为体积比1∶1，饲养25 kg左右的生猪40头。在猪栏纵向中轴线上距栏边沿1、3、5 m处设3个样点，每个采样点直径约40 cm，将垫料上下纵深翻匀，取样500 g待用，采样10个猪栏共30个样品，按照栏位样点顺序编号为1、2、3、…、30。从第2批生猪进栏舍起，每间隔15 d取样一次，共取样5个批次。
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图 1 栏舍取样样点 Figure 1 Schematic diagram of sampling |
采用牛肉膏蛋白胨培养基(NA)培养细菌，马铃薯培养基(PDA)培养真菌，高氏培养基(改良)培养放线菌。称取10 g样品加入100 mL无菌水中，摇床振荡15 min，使之充分混匀，梯度稀释至10-2、10-3、10-4、10-5。每个浓度每种培养基平板涂布3块，每块平板涂布菌悬液200 μL。静置20 min，倒置于恒温箱中培养。细菌30℃，1~2 d；真菌25℃，2~6 d；放线菌28℃，5~7 d。统计菌落种类和数量，计算对应样品微生物的含量。
1.4 发酵床垫料微生物生态分布多态性分析以样点为样本，以垫料中微生物含量为指标，进行聚类分析，将30个样点根据微生物含量(细菌、真菌、放线菌)分为高含量、中含量和低含量3个类群。绘制细菌/真菌/放线菌样点生态分布格局平面图，类群Ⅰ(高含量)，图中以黑色标示；类群Ⅱ(中含量)，图中以灰色标示；类群Ⅲ(低含量)，图中以白色标示。
2 结果与分析 2.1 微生物发酵床养猪垫料微生物的数量分布多态性发酵床垫料微生物的数量分布多态性结果见表 1。由于各栏圈生猪的生长状况、行为习惯均以及人为操作管理均存在差异，采样期间各垫料样品的微生物的含量及结构也存在显著差异。整体取样30个样点中5次取样过程中，微生物含量总体为细菌>放线菌>真菌。细菌含量最低为5.23×105 cfu·g-1，最高达1 930.00×105 cfu·g-1；放线菌含量最低为3.50×104 cfu·g-1，最高达122.00×104 cfu·g-1；真菌含量最低为0.75×103 cfu·g-1，最高达277.5×103 cfu·g-1。从各次取样总体平均值来看，细菌含量变化幅度最大[(33.72~197.23)×105 cfu·g-1]，真菌含量变化相对较小[(7.87~48.64)×103 cfu·g-1]，而放线菌含量变化相对稳定[(20.14~33.18)×104 cfu·g-1]。
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表 1 微生物含量统计 Table 1 The content of microbes population in the fermentation bed |
根据细菌含量为指标，将30个样点分为3类：类群Ⅰ为高含量，大于70.00×105 cfu·g-1，类群Ⅱ为中含量，为(30.00~70.00)×105 cfu·g-1，类群Ⅲ为低含量，小于30.00×105 cfu·g-1。根据各样点细菌的含量类别，绘制样点分布格局平面图 2。第1批取样(图 2-A)细菌类群Ⅰ仅包括1个样点10，细菌含量为70.25×105 cfu·g-1；类群Ⅱ包括16个样点，分别为样点1、2、3、4、13、15、17、18、21、22、24、26、28、29和30，含量为(30.00~60.00)×105 cfu·g-1；余下的13个样点均属于类群Ⅲ，含量低于30.00×105 cfu·g-1，其中样点16含量最低为5.53×105 cfu·g-1。第2批取样(图 2-B)类群Ⅰ包括10个样点，分别为样点1、2、4、5、19、、22、23、24、25和29，其中样点5含量最高为164.75×105 cfu·g-1；类群Ⅱ包括13个样点，分别为样点3、7、9、10、11、14、16、18、20、21、26、27和28，含量为(30.50~69.50)×105 cfu·g-1；类群Ⅲ包括余下的7个样点，其中样点15含量最低为8.25×105 cfu·g-1。第3批取样(图 2-C)类群Ⅰ包括11个样点，分别为样点1、2、7、10、13、14、22、24、25、28和30，其中样点10细菌数量最高为865.00×105 cfu·g-1；类群Ⅱ包括13个样点，分别为样点3、4、5、8、9、12、15、17、20、21、23、26和27，含量为(34.50~66.50)×105 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余6个样点，其中样点18含量最低为8.25×105 cfu·g-1。第4批取样(图 2-D)类群Ⅰ包括15个样点，分别是样点1、13、16、18、19、20、21、22、23、24、26、27、28、29和30，其中样点1细菌含量最高为1930.00×105 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括7个样点，分别是样点2、4、5、7、9、12和25，含量为(32.00~64.75)×105 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余8个样点，其中样点1含量最低为13.00×105 cfu·g-1。第5批取样(图 2-E)类群Ⅰ包括9个样点，分别是样点2、3、4、6、23、27、28、29和30，其中样点3细菌含量最高为602.50×105 cfu·g-1；类群Ⅱ包括13个样点，分别是1、5、7、8、9、12、13、14、15、19、22、24和26，细菌含量为(38.25~68.00)×105 cfu·g-1；类群Ⅲ包括8个样点，分别为样点10、11、16、17、18、20、21和25，其中样点11细菌含量最低为10.10×105 cfu·g-1。
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图 2 各批次样品细菌的空间分布 Figure 2 Spatial distribution of bacterial in the fermentation bed |
根据真菌含量将30个样点分类分为3类：类群Ⅰ为高含量，大于70.00×103 cfu·g-1；类群Ⅱ为中含量，为(30.00~70.00)×103 cfu·g-1；类群Ⅲ为低含量，小于30.00×103 cfu·g-1。根据各样点真菌含量的类别，绘制样点分布格局平面图 3。第1批取样(图 3-A)类群Ⅰ包括样点2、5和9，真菌含量高于80.00×103 cfu·g-1，其中样点9最高为102.50×103 cfu·g-1；类群Ⅱ包括11个样点，分别为样点1、3、6、7、8、14、15、17、25、26、27，含量为(31.50~60.00)×103 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余16个样点，含量为(1.05~26.50)×103 cfu·g-1，其中样点12真菌含量最低为1.05×103 cfu·g-1。第2批取样(图 3-B)类群Ⅰ包括8个样点，分别是样点4、5、9、14、25、26、27、28，其中样点26真菌含量最高为192.50×103 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括6个样点，分别是样点1、6、7、8、13和15，含量为(32.50~67.55)×103 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余16个样点，含量为(1.05~27.75)×103 cfu·g-1，其中样点12含量最低为1.05×103 cfu·g-1。第3批取样(图 3-C)类群Ⅰ包括样点19、20、21和25，其中样点19真菌含量最高为277.50×103 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括10个样点，分别是样点1、2、7、9、13、14、15、17、26、27和28，真菌含量为(30.00~62.50)×103 cfu·g-1；其余16个样点属于类群Ⅲ，真菌含量变化范围为(2.75~25.00)×103 cfu·g-1，其中样点12最低为2.75×103 cfu·g-1。第4批取样(图 3-D)类群Ⅰ包括样点16、18和19，其中样点19真菌含量最高为162.50×103 cfu·g-1；类群Ⅱ中样点13、15、20和21，含量范围为(32.50~57.50)×103 cfu·g-1；其余23个样点属于类群Ⅲ，含量变化范围为(1.50~25.00)×103 cfu·g-1，其中样点24含量最低为1.50×103 cfu·g-1。第5批取样(图 3-E)。类群Ⅰ仅包括1个样点18，真菌含量为80.00×103 cfu·g-1；类群Ⅱ仅包括1个样点17，含量为35.00×103 cfu·g-1；其余28个样点均属于类群Ⅲ，真菌含量为(0.75~10.00)×103 cfu·g-1，其中样点10含量最低为0.75×103 cfu·g-1。在5批采样过程中，样点10、11、12、22、23、24、29和30真菌含量稳定，属于类群Ⅲ。
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图 3 各批次样品真菌的空间分布 Figure 3 Spatial distribution of fungal in the fermentation bed |
根据放线菌含量将30个样点分类分为3类：类群Ⅰ为高含量，大于70.00×104 cfu·g-1，类群Ⅱ为中含量，为(30.00~70.00)×104 cfu·g-1，类群Ⅲ为低含量，小于30.00×104 cfu·g-1。根据各样点放线菌含量的类别，绘制样点分布格局平面图 4。第1批取样(4-A)类群Ⅰ包括仅1个样点2，放线菌含量为78.00×104 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括9个样点，分别是样点7、8、9、12、13、15、17、18和24，含量为(32.00~66.50)×104 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余20个样点，含量为(3.50~28.00)×104 cfu·g-1，其中样点5和30含量最低为3.50×104 cfu·g-1。第2批取样(图 4-B)类群Ⅰ仅包括1个样点26，放线菌含量为73.00×104 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括8个样点，分别是样点7、8、 9、14、15、25、27和30，含量为(35.00~59.75)×104 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余21个样点，放线菌含量变化范围为(11.00~29.75)×104 cfu·g-1，其中样点4含量最低为11×104 cfu·g-1。第3批取样(图 4-C)类群Ⅰ包括样点9、19和21，其中样点19放线菌含量最高为122.00×104cfu·g-1；类群Ⅱ中包括9个样点，分别是样点7、13、14、15、17、20、25、26和30，含量为(35.50~54.50)×104cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余18个样点，含量变化范围为(1.75~28.50)×104 cfu·g-1，其中样点1含量最低为1.75×104 cfu·g-1。第4批取样(图 4-D)类群Ⅰ仅包括1个样点3，放线菌含量为83.00×104 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括7个样点，分别是样点2、4、5、6、7、8和9，含量范围为(30.50~49.75)×104 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余22个样点，放线菌含量范围为(0.70~28.50)×104 cfu·g-1，其中样点30含量最低为0.70×104 cfu·g-1。第5批取样(图 4-E)类群Ⅰ仅包括1个样点28，放线菌含量为85.00×104 cfu·g-1；类群Ⅱ中包括9个样点，分别是样点2、8、14、15、16、18、23、29和30，含量为(30.00~61.00)×104 cfu·g-1；类群Ⅲ包括其余20个样点，含量变化范围为(3.45~28.50)×104 cfu·g-1，其中样点1含量最低为3.45×104 cfu·g-1。
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图 4 各批次样品放线菌的空间分布 Figure 4 Spatial distribution of actinomyces in the fermentation bed |
在整个取样过程中，放线菌含量类群Ⅰ样点分布很少，第30 d类群Ⅰ有3个样点，其余时间均为1个样点，类群Ⅲ比较多，多于18个样点；样点10和11放线菌分布比较稳定，属于类群Ⅲ。
2.3 微生物发酵床养猪垫料微生物时间分布多态性 2.3.1 微生物发酵床养猪垫料细菌类群时间分布多态性微生物发酵床养猪垫料细菌类群分布比例见图 5。高含量类群Ⅰ在5个批次中样点数量分别为1、10、11、15、9个，平均为9.2个。在总体30个样点比例趋势为先升后降，为3.33% → 33.33% → 36.67% → 50% → 30.00%，变化趋势符合函数：y =-0.1667x3 -0.4286x2 + 9.7381x -7.8，R2 =0.9215。细菌含量类群变化趋势函数生物学意义为：y为各批次本特征样点的数量，x代表采样的批次(每15 d 1次)，通过函数计算出下批次样点中细菌高含量样点的数量，进而评估垫料发酵状况。
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图 5 微生物发酵床垫料细菌含量类群多态性 Figure 5 The diversity of bacterial content in the fermentation bed |
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图 6 微生物发酵床垫料真菌含量类群多态性 Figure 6 The diversity of fungal content in the fermentation bed |
类群Ⅱ在5个批次中样点数量分别为16、13、13、6、13个，平均为12.2个。在总体样点数量所占比例变化与类群Ⅰ相反，为先降后升，为53.33% → 43.33% → 43.33%→ 20.00% → 43.33%，变化趋势符合函数：y =0.75x3 -5.8929x2 + 11.357x + 9.4，R2 =0.7589。
类群Ⅲ在5个批次中样点数量分别为13、7、6、9、8个，平均为8.6个。所占样点比例总体变化与与类群Ⅱ相似，为先降后升，为43.33% → 23.33% → 20.00% → 30.00% → 26.67%，变化趋势符合函数：y =-0.5833x3 + 6.3214x2 -21.095x + 28.4，R2 =0.9956。
2.3.2 微生物发酵床养猪垫料真菌类群时间分布多态性微生物发酵床养猪垫料真菌类群分布见6。类群Ⅰ在5个批次中样点数量分别为3、6、4、3、1个，平均为3.8个。所占样点比例总体为先升后降，10.00%→26.67%→13.33%→ 10.00%→3.33%，变化趋势符合函数：y =0.6667x3 -6.7857x2 + 19.548x -10.2，R2 =0.8635。
类群Ⅱ在5个批次中样点数量分别为11、6、10、4、1个，平均为6.4个。所占样点比例总体为先降后升，为36.67%→20.00%→ 33.33%→13.33%→3.33%，变化趋势符合函数：y =-0.5x3 + 4.0714x2 -11.429x + 18.4，R2 =0.7886。
类群Ⅲ在5个批次中样点数量分别为16、16、16、23、28个，平均为19.8个。所占样点比例总体为平稳上升，为53.33%→53.33%→53.33%→76.67%→93.33%)，变化趋势符合函数：y =-0.1667x3 + 2.7143x2 -8.119x + 21.8，R2 =0.9697。
2.3.3 微生物发酵床养猪垫料放线菌类群时间分布多态性微生物发酵床养猪垫料放线菌类群分布见图 7。类群Ⅰ在5个批次中样点数量分别为1、1、3、1、1个，平均为1.4个。所占样点比例总体为先升后降，3.33%→3.33%→10%→ 3.33%→3.33%，变化趋势符合函数：y =0.5x4 -6x3 + 24.5x2 -39x + 21，R2 =1。
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图 7 微生物发酵床垫料放线菌含量类群多态性 Figure 7 The diversity of actinomyces content in the fermentation bed |
类群Ⅱ在5个批次中样点数量分别为9、8、9、7、9个，平均为8.4个。所占样点比例相当较为平稳，为30.00%→26.67%→ 30.00%→23.33%→30.00%，变化趋势符合函数：y =0.5x4 -5.8333x3 + 23.5x2 -38.167x + 29，R2 =1。
类群Ⅲ在5个批次中样点数量分别为20、21、18、22、20个，平均为20.2个。所占样点比例较高，但数量比例相当平稳，为66.67%→70.00%→60.00%→73.33%→66.67%，变化趋势符合函数：y =-1x4 + 11.833x3 -48x2 + 77.167x -20，R2 =1。
2.4 微生物发酵床养猪垫料微生物类群分布多态性5个批次样品中，细菌高含量类群Ⅰ和低含量类群Ⅲ所占样点比例相近，类群Ⅰ平均9.2个样点、占比28.67%；类群Ⅲ平均为8.6个样点，占比30.67%；类群Ⅱ平均为12.2个样点，所占比例最大为40.67%。
真菌则类群Ⅰ平均仅3.8个样点，所占比例最低，为12.67%；类群Ⅱ平均为6.4个样点，所占比例为21.33%；类群Ⅲ平均19.8个样点，所占比例高达66.00%。
放线菌3种类群所占比例与真菌类似，类群Ⅰ平均仅1.4个样点，所占比例最低，仅为4.67%；类群Ⅱ平均8.4个样点，所占比例为28.00%；类群Ⅲ平均20.2个样点，所占比例高达67.33%。
3 讨论与结论粪污的降解是通过微生物完成的，微生物良好的发酵状态是发酵床养殖技术的核心，了解垫料各种状态下微生物的空间分布状况是评价养殖垫料发酵程度的重要研究手段。刘云浩等[7]通过对比6种关于养猪发酵床垫料微生物总DNA的提取方法，表明SDS-CTAB结合法是一种高效、可靠的垫料微生物总DNA提取方法，有利于进行下游的分子生态学研究。郭艳等[8]研究了猪粪堆肥升温期细菌的分子生态学，表明堆肥样品都具有较丰富的微生物种群多样性，同时存在着明显的优势种群结构变化，中层多样性最为丰富。王潇娣等[9]采集不同年龄阶段猪只肠道内容物及不同饲养阶段发酵床垫料进行细菌分离，研究表明不同年龄猪肠道以及发酵床分离细菌种类相同，但是细菌含量存在差异。主要分离菌有大肠杆菌、葡萄球菌、沙门氏菌、链球菌、黏液性枯草芽孢杆菌、普通枯草芽孢杆菌。李婧[10]通过Real-Time PCR技术对不同深度中发酵床垫料中大肠杆菌、乳酸杆菌、产甲烷菌进行定量分析。发酵床垫料中表层大肠杆菌数量最多，达到9.68×105CFU·g-1，随着深度递增，大肠杆菌数量减少，40 cm深度处数量最少。乳酸杆菌存在于表层数量少，仅为3.69×103CFU·g-1。随着深度的增加，乳酸杆菌数量呈上升趋势，15 cm处达到最高值6.08×103CFU·g-1。40 cm处乳酸杆菌数量最低，为1.16×102CFU·g-1。本研究采集10个猪栏30个样点5个批次的样品，采用平板分离法研究其中细菌、真菌、放线菌的数量动态，期间30个垫料样品的微生物的含量及结构也存在显著差异，微生物含量总体为细菌>放线菌>真菌。其中细菌含量变化幅度最大[(33.72~197.23)×105 cfu·g-1]，真菌含量变化相对较小[(7.87~48.64)×103 cfu·g-1]，而放线菌含量变化相对稳定[(20.14~33.18)×104 cfu·g-1]。
空间分布是同类空间事物的群体定位信息的反应，特定分布区域中的分布对象是单一性质的。空间对象按空间实体的几何形态划分为点、线、面，不同的空间分布对象具有不同的空间分布特征，并且具有各自相应的空间分布参数。Hao X等[11]研究了弱酸性电解质水对猪舍内环境空间的影响，结果表明，空气中的细菌和真菌的数量显著下降(P ＜0.05)。刘波等运用脂肪酸生物标记法研究了零排放猪舍基质垫层微生物群落的多样性，结果表明不同生物标记多样性指数在基质垫层不同层次分布不同，提出了微生物群落分布的特征指标，构建发酵指数指示基质垫层的发酵特性[4-5]。本研究的30个样点5批次取样分析中，细菌高含量(大于70.00×105 cfu·g-1)、中含量[(30.00~70.00)×105 cfu·g-1]、低含量(小于30.00×105 cfu·g-1)的样点数量平均分别为9.2、12.2、8.6个，占总样点比例分别为30.67%、40.67%和28.67%。真菌高含量(大于70.00×103 cfu·g-1)平均样点为3.8个，占总样点数的12.67%；中含量[(30.00~70.00)×103 cfu·g-1]样点数平均为6.4个，占总样点数的21.33%；低含量(小于30.00×103 cfu·g-1)的样点数量则为19.8个，占总样点数的66%；即整个研究阶段，真菌数量相对较低。而放线菌高含量(大于70.00×104 cfu·g-1)平均样点为1.4个，占总样点数的4.67%；中含量[(30.00~70.00)×104 cfu·g-1]样点数平均为8.4个，占总样点数的28%；低含量(小于30.00×104 cfu·g-1)的样点数量则为20.2个，占总样点数的67.33%。
研究表明很多放线菌可产生多种抗生素和酶，在微生物产生的新生物活性物质中，放线菌产生的就占到了74%[12]。植物土传病害逐渐严重伴随着根系微生物区系的失调，表现在真菌的增长幅度大，而细菌和放线菌的比例呈下降或小幅增长趋势，细菌性土壤变为真菌性土壤，结果造成土壤理化性质改变，增加了植物病虫害的侵染程度[12-15]。在微生物发酵床养猪过程中，垫料中的微生物(细菌、真菌、放线菌)在生猪的活动和管理操作的影响下随时变化。从本研究的30个样点微生物的分布状况来看，细菌各类群的分布呈现随机的特性，没有明显的规律，但总体上含量是远高于真菌和放线菌。放线菌在各样点的分布也是以低含量为主，其中样点10、11、22在整个采样分析期间均处于低含量分布。真菌的含量最少，各样点以低含量分布为主，其中样点10、11、12、22、23、24、29和30这8个样点在5次采样分析中均处于低含量分布。在土壤真菌中，植物的病原真菌的比例显著高于细菌和放线菌，有机无机肥配施相对增加了土壤细菌和放线菌的数量，可能减少土壤中的病原真菌数量[16-19]。发酵床垫料类似于土壤的体系，因此，从研究结果判断，发酵床垫料处于一个较好的发酵状态，能够及时分解消纳生猪排泄的粪污。
微生物发酵床养猪是一项应用不久的技术，对于垫料发酵状况、评价标准等尚缺乏系统的研究。本研究对垫料中可培养的微生物(细菌、真菌、放线菌)数量分布动态进行了研究，研究结果仅揭示了垫料中微生物群落动态的部分信息。对于全面了解垫料中微生物的动态信息，尚需要辅助更先进的、多样化的研究手段。
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