2015, Vol. 30
2. 广东省茂名市化州中学, 广东 茂名 525100
2. Huazhou High School, Maoming, Guangdong 525100, China
蝴蝶兰Phalaenopsis是兰科蝴蝶兰属植物，在中国台湾、泰国、菲律宾、马来西亚、印度尼西亚等地都有分布。蝴蝶兰被誉为“兰中皇后”，近几年迅速成为盆花中最流行的品种，为年宵花首位[1]。由于蝴蝶兰的生产设备具有很强的复制性，现在全国各个地区，从南方到北方，都在进行蝴蝶兰的生产[2, 3, 4]，蝴蝶兰的产业由此得到快速发展，产量极速增加。但是近年由于受国内外经济形势的影响，蝴蝶兰的销售在2012、2013年陷入低谷期，重要因素之一是新品种缺乏，很多蝴蝶兰生产商主要集中生产几个流行的品种，品种单一造成市场大幅度滑坡。
为促进蝴蝶兰产业的持续发展，除了加强蝴蝶兰新品种的选育，还需要加强新品种的组织培养配套生产技术研究以促进推广生产，使新品种得以迅速进入消费市场，抢占市场先机。黄象男等[5]、曾碧玉等[6]、张彦妮等[7]、谭鹏鹏等[8]有过对蝴蝶兰的组培技术的研究，但实验室研究与工厂化生产育苗有很大的区别。工厂化生产育苗需要配方稳定、增殖系数高的实用化组培生产技术模式，而由于正交设计是多因素分析的有力工具，可用较少的试验次数获得较多的信息,林宗铿等[9]、李成慧等[10]、王冬云等[11]已应用在蝴蝶兰组培技术研究。为此选择最近流行的蝴蝶兰“大辣椒”品种进行实用化组培技术生产研究，采用正交设计法对不定芽诱导、不定芽增殖、丛生芽壮苗和生根培养基进行对比分析，以优化培养基配方，以期建立一整套蝴蝶兰实用化组培生产技术流程，满足工厂化生产的要求。
1 材料与方法 1.1 试验材料选择蝴蝶兰品种“大辣椒”为试验材料，采集供试品种幼嫩的花梗，其母株花芽饱满，排列正常、花形也对称、无瑕疵。
1.2 试验方法 1.2.1 花梗消毒从母株上切下带有腋芽的蝴蝶兰幼嫩花梗，用自来水冲洗干净，并用无菌滤纸将其擦干净，然后，将其切成长2.0 cm的小段，每段带1个花芽。在超净工作台上先用75%的酒精漂洗20 s；迅速放入到0.1%升汞溶液中浸泡10 min；浸泡完毕之后用无菌水冲洗4次，然后将其放在无菌碟子切去两端伤口，并放置30 min，等到花梗晾干之后，接种到不同的诱导培养基上；先暗培养15 d，然后再将其放入光照条件下培养。培养室温度为(28士3)℃，光/暗周期为14 h/10 h，光照强度3 500~4 000 lx。
1.2.2 培养基的配置试验利用MS，花宝1号，KC为基本培养基，在基础培养基上按不同的培养阶段添加不同浓度、不同配比的植物生长调节剂(NAA、6-BA)，并添加椰子汁、马铃薯、香蕉等天然添加物，其中马铃薯剥皮称质量后，切成小碎块煮烂用纱布过滤后使用，成熟香蕉剥皮研磨成香蕉泥。调节所有培养基的pH值为5.8，并用1 g·L-1卡拉胶固化，分装到350 mL三角瓶中，在121℃条件下灭菌24 min，待冷却凝固后使用。
1.2.3 不定芽诱导为筛选出促使腋芽萌发最为适宜的培养基和激素浓度，蝴蝶兰“大辣椒”花梗不定芽诱导培养基因素与水平见表 1，其L9(33)正交设计试验因素与水平组合见表 1，将花梗切段后，按自然生长状态接种到不同基本培养基、不同生长调节剂配比的培养基上，每个处理接种30个花梗段，共接种270个花梗段，每个培养都添加了150 mL·L-1椰汁(CM)、香蕉泥200 g·L-1、马铃薯泥200 g·L-1、糖20g ·L-1、水解乳蛋白1 g·L-1。不定芽诱导培养基的正交试验设计因素与水平见表 1。
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表 1 蝴蝶兰“大辣椒”不定芽诱导培养基因素及水平L9(33) Table 1 L9(33) factors and levels on medium for bud induction on Big Chili Phalaenopsis |
为筛选出不定芽增殖及分化最为适宜的培养基和植物生长调节剂含量，蝴蝶兰“大辣椒”不定芽增殖及分化培养基因素与水平见表 2，其L9(34)正交设计试验因素与水平的组合见表 2，将不定芽切取之后，按自然生长状态接种到不同基本培养基、不同生长调节剂配比的培养基上，每个处理接种30棵不定芽，共接种300棵不定芽，每个培养都添加了150 mL ·L-1椰汁(CM)、香蕉泥200 g·L-1、马铃薯泥200 g·L-1、糖20g ·L-1、并附加0.5 g·L-1活性炭(AC)。
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表 2 蝴蝶兰“大辣椒”不定芽增殖及分化培养基因素及水平L9(34) Table 2 L9(34) factors and levels on medium for adventitious bud proliferation and differen tiationon Big Chili Phalaenopsis |
为筛选出最为适宜的壮苗及生根培养基，本研究主要对植物生长调节剂含量和配比做些调整，蝴蝶兰“大辣椒”壮苗和生根培养基的因素与水平见表 3。小苗分别接种在接种到不同的壮苗和生根培养基上(表 10)，每个处理接种10瓶(每瓶10芽)，共接种60瓶 。都添加了150 mL·L-1椰汁(CM)、香蕉泥200 g·L-1、马铃薯泥200 g·L-1、糖20 g·L-1，并附加0.5 g·L-1活性炭(AC)。培养条件以日光灯为光源，无菌苗光照时间为每天12 h，光照强度为1 400~1 800 lx，温度为26℃左右。1.2.6 组培苗的驯化和移栽
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表 3 蝴蝶兰“大辣椒”壮苗及生根培养基的因素与水平 Table 3 Factors and levels on culture medium for seedling development and rooting of Big Chili Phalaenopsis |
小苗经过3个月左右的生根培养，等到叶片长度达到5 cm左右，同时根的长度也达到了5 cm左右就可以移入温室中进行炼苗。炼苗过程要将小苗根部的培养基洗干净，同时用多菌灵或高锰酸钾进行消毒，然后栽入水草基质中进行生长。
1.3 调查统计分析每15 d调查1次瓶苗生长情况，统计不定芽的诱导及增殖数量;接种后15 d统计生根数量，计算生根率，并利用SPSS 21软件对试验数据进行方差分析和单因子主效应分析。
2 结果与分析 2.1 不同基本培养基、植物生长调节剂配比对花梗不定芽的诱导效果比较将花梗段接种在不定芽诱导培养基上，培养15 d后不定芽开始膨大，20 d后萌发长出小叶，30 d形成1个不定芽(图 1)。试验结果表明(表 4)用花梗作为初次外植体接入不定芽诱导培养基中，由于污染的原因，造成接种瓶数损失较大，为20%~30%。同时，所诱导出来的不定芽长势，一般是激素含量越高，芽比较小，叶色就会出现由水泽状，生长速度快。
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图 1 花梗诱导出不定芽 Fig. 1 Pedicel induced adventitious buds |
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表 4 不同基本培养基、不同植物生长调节剂配比对花梗不定芽诱导效果影响 Table 4 Effect of basic media and hormones on adventitious buds induction |
方差分析结果表明(表 5)：基本培养基对出芽率的影响(Sig.=0.003)呈极显著性(P＜0.01)，NAA对出芽率的影响(Sig.=0.199)表现不明显(P>0.05)，BA对对出芽率的影响(Sig.=0.014)呈显著性(P＜0.05)，3个因素中对出芽率影响大小次序依次为基本培养基>BA>NAA。
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表 5 培养基和植物生长调节剂对出芽率的影响方差分析 Table 5 Results ofvariance analysis |
单因子主效应分析对出芽率的影响，表 6结果分析表明：对于提高出芽率来说，基本培养基应选择花宝一号(均值最大，为67.29)，NAA含量应该为0.3 mg·L-1(均值最大，为36.56)，6-BA含量应该为5 mg·L-1(均值最大，为49.80)，因此对于不定芽诱导的最佳培养基为基础培养基：花宝一号；NAA:0.3 mg·L-1；6-BA：5 mg·L-1。
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表 6 单因素影响出芽率统计结果 Table 6 Statistical results on single factor affecting sprouting rate |
花梗不定芽诱导出来之后，将所获得的不定芽在无菌操作台上分切为单芽后转入准备好的不定芽增殖及分化培养基里面进行培养之后，发现20 d其不定芽就逐渐萌发出芽眼，再过20 d之后，逐渐长出小叶并舒展，叶色由渐渐白转为淡绿、鲜绿、浓绿(图 2、3)。
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图 2 不定芽增殖前表现 Fig. 2 Adventitious buds before proliferation |
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图 3 不定芽增殖后表现 Fig. 3 Adventitious buds after proliferation |
通过不同基本培养基、不同植物生长调节剂配比对不定芽增殖及分化效果影响(表 7)，表明将所获得的不定芽转入到增殖和分化培养基中，污染数比较低为0~2%，符合一般组培公司操作污染的规定(夏天污染不能超过10%，冬天污染不能超过4%)，同时，植物生长调节剂越高，丛生芽眼的数量增长也越多，但是，也存在芽体生长不正常的现象，如玻璃化，变异现象的出现。增殖系数最高的培养基为花宝一号+NAA 0.2 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1达到5.53倍。
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表 7 不同基本培养基、不同植物生长调节剂配比对不定芽增殖及分化效果影响 Table 7 Effect of basic media and hormones on proliferation and differentiation of adventitious buds |
通过方差分析增殖系数的影响(表 8)：基本培养基的显著值Sig.为0.005(P＜0.01)对增殖系数有极显著性影响，NAA的显著值Sig.为0.049(P＜0.05)对增殖系数有显著性影响，BA的显著值Sig.为0.013(P＜0.05)对增殖系数有显著性影响。3个因素中，影响大小次序依次为基本培养基>BA>NAA。
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表 8 培养基和植物生长调节剂对增殖系数的影响方差分析 Table 8 Effect of multiplication factor on variance analysis |
单因子主效应分析对增殖系数影响统计结果(表 9)，表明对于提高增殖系数来说，基本培养基应选择花宝一号(均值最大，为4.43)，NAA含量应该为0.2 mg·L-1(均值最大，为3.33)，6-BA含量应该为6 mg·L-1(均值最大，为3.51)，因此，对于不定芽增殖和分化的最佳培养基为基础培养基：花宝一号；NAA： 0.2 mg·L-1；6-BA：6 mg·L-1。
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表 9 单因素影响增殖系数统计结果 Table 9 Statistical results of single factor affecting multiplication factor |
将无根丛生芽分开后接种到生根培养基中，20 d左右根就开始萌发，2~3个月就可移栽(图 4)。选用不同的基本培养基对萌发并具有4~5片叶的小苗进行生根培养结果(表 10)，表明低盐培养基1/2MS较适合生根培养。在培养基2中，生根率为96%，且根长势健壮，数量多;而以花宝一号为基本培养基中，生根率最高为44%，最低为34%，且长势较弱；以NAA 0.2 mg·L-1根长势较好；椰子汁、苹果汁、土豆汁作为复合添加物对生根较为有利。最佳的壮苗和生根培养基为1/2MS+0.2 mg·L-1。
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图 4 组培苗 注：A为生根前表现，B为生根后表现。 Fig. 4 Seedlings |
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表 10 不同基本培养基、不同植物生长调节剂配比对蝴蝶兰的壮苗及生根培养基影响 Table 10 Effect of basic media and hormones on medium for seedling development and rooting of Phalaenopsis |
选取根系发达、粗壮、长4~5 cm的试管苗，在移栽前先经炼苗培养，即将试管苗(未打开培养瓶盖)放在温室大棚里面的滚床上，室温下30 d，等到三角瓶里面的蝴蝶兰生根苗的叶子由鲜绿变为墨绿之后，再打开瓶盖在室温下放置20 d，然后移栽，所用基质是消毒灭菌的水苔，加盖塑料薄膜，薄膜上有通风小口，基质用营养液喷湿，但不能过湿，置于散射光下生长。待蝴蝶兰根系成活后，再喷洒清水1次，然后每隔7 d浇水1次，这样蝴蝶兰成活率较高，一般的成活率在91.5%以上。
2.5 蝴蝶兰温室管理蝴蝶兰属于热带阴生植物，喜高温不耐严寒，在温度5℃以下便会死亡，如果温度低于10℃时蝴蝶兰的花瓣上就容易出现黑色的斑点，冬季要注意防寒。同时，蝴蝶兰喜欢高湿的环境，根部又忌积水，因此，蝴蝶兰喜通风，水分过多，容易引起根部腐烂，对于刚出瓶的小苗就要及时补充水分，中苗或大苗应根据干湿程度浇水，一般7~10 d基质变干，盆面发白时宜浇水，浇水时要让盆中水苔湿透，并且夏季通风不良植株易染病，日常管理注意光照不宜过强，施肥根据不同生长需要来完成，栽成活率达到91.5%。组培苗移栽4~6周之后可适当施一些液体肥料，每周1次。一般栽培2年时间就可以根据销售需求来调控其抽花梗以及开花时间，以达到既满足市场对蝴蝶兰的需求，又能够达到盈利目的.
3 讨论与结论影响组培效果的因素主要有污染、褐化问题。本研究过程笔者不建议采取添加抗菌剂，尽可能采用升汞进行蝴蝶兰花梗以及叶片表面消毒，这与何荆州等[12]研究一致的。本研究采取尤海龙等[13]、唐德华等[14]在培养基里面添加适当含量的PVP和VC，新组培的瓶苗采取在低温17~20℃、黑暗培养7 d，再转到正常温度、光照培养，能较大降低褐化程度。同时生根培养基中添加活性炭，褐化效果更好。
研究结果表明，选择花宝一号为基本培养基，不定芽诱导的最佳培养基为：花宝一号+NAA 0.3 mg·L-1+6-BA 5 mg·L-1；不定芽增殖和分化的最佳培养基为：花宝一号+NAA 0.2 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1，增殖系数最高达到5.53倍。在工厂化生产中，一般都是使用花宝一号作为诱导以及增殖培养基使用，张伟等[15]在蝴蝶兰组培中就发现在MS+3.0 mg·L-1 6-BA+1.0 g·L-1花宝1号培养基中诱导出营养芽,其诱导率达90%，叶秀仙等[16]在添加甘露醇15 g·L-1或多效唑(PP333)6.0 mg·L-1的13.0 g·L-1+AC 0.5 g·L-1+蔗糖20 g·L-1培养基上保存18个月,存活率达80.0%以上,且保持较高的增殖速率,增殖系数4.1,这都意味着蝴蝶兰应用花宝一号作为培养基具有更强的实用性。同时研究发现最佳的壮苗和生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg·L-1，生根率为96%，椰子汁、苹果汁、土豆汁作为复合添加物对生根较为有利，这与很多蝴蝶兰组培研究者[5, 6, 7, 8]利用1/2MS作为壮苗和生根培养基的结果是一致的。兰组培研究者[5, 6, 7, 8]利用1/2MS作为壮苗和生根培养基的结果是一致的。
本研究采用蝴蝶兰品种“大辣椒”幼嫩花梗作为试验材料，通过正交试验设计研究基本培养基、激素成分及浓度水平对花梗不定芽的诱导、增殖、分化、生根的影响，以及蝴蝶兰温室管理等方面进行了较为系统的研究，建立了蝴蝶兰组织培养与快速繁殖技术体系，可为工厂实用化种苗生产提供技术支持。
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