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中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

王伟英 李海明 戴艺民 李跃森 邹晖 吴水金 林江波

引用本文:
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中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

    作者简介: 王伟英(1980-), 女, 硕士, 助理研究员, 主要从事植物逆境生理和分子生物学研究(E-mail:weiyingwang178@126.com)
    通讯作者: 林江波(1976-)男, 硕士, 副研究员, 主要从事分子生物学研究(E-mail:linjiangbo1976@yahoo.com.cn)
  • 基金项目:

    福建省自然科学基金项目(2014J01098)

  • 中图分类号: Q522

Prokaryotic Expression of 3 GT Gene from Narcissus tazetta var. Chinensis

图(4)
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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2016-05-16
  • 修改稿:  2016-05-30

中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

    通讯作者: 林江波, linjiangbo1976@yahoo.com.cn
    作者简介: 王伟英(1980-), 女, 硕士, 助理研究员, 主要从事植物逆境生理和分子生物学研究(E-mail:weiyingwang178@126.com)
  • 福建省农业科学院亚热带农业研究所, 福建 漳州 363005
基金项目:  福建省自然科学基金项目 2014J01098

摘要: 通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55 kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。

English Abstract

  • 中国水仙Narcissus tazetta. var. Chinensis隶属石蒜科水仙属Amaryllidaceae,多年生草本植物,是多花水仙的一个变种。类黄酮-3-O-葡萄糖基转移酶(3GT)是花青苷(Anthocyanins)生物合成途径中的关键酶, 它主要负责将不稳定的花色素转变为稳定的花色素苷, 催化无色的花色素生成有色的花色苷, 对花色起着调控作用[1-3]。目前已经对多种植物的3GT已有深入的研究[4-7],通过基因工程来改变花色是观赏植物的花色改良和培育新品种的重要方法。但曾黎辉[8]等认为缺乏花青素可能是中国水仙花色单一的主要原因,推测中国水仙花瓣和副冠中也缺少ANS基因的表达,没有ANS基因的表达可能是中国水仙不能合成花青素的主要原因。对于这个推测还需要更多的研究来进一步验证,以期早日培育水仙新品种。

    本作者在已发表的“中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的克隆与表达分析”[4]的研究中从中国水仙上分离克隆得到Nt3GT基因,其cDNA全长1 682 bp,包含有1个1 461 bp完整阅读框架(ORF),编码487个氨基酸,具有Glycos_tranf_1superfamily蛋白保守区。要了解Nt3GT在植物体内的酶学特性和生物学功能,必须要在蛋白水平进行研究。原核表达系统具有产量高、易操作、稳定性好、经济实惠等优点[9-11],为研究Nt3GT蛋白的表达和功能提供了一条有效的途径。本研究是利用pET29a为载体,探索NT3GT在大肠杆菌BL21中的表达,为进一步研究NT3GT 蛋白结构和功能的关系提供了试验基础,也为下一步利用花色基因进行遗传转化奠定基础,以期为中国水仙花色遗传改良提供一条新途径。

    • 前期在“中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的克隆与表达分析”[4]的实验中已储存本试验所需试验材料。

    • 大肠杆菌(Esherichia coli)的菌株HB101和BL21(DE3)由福建省农业科学院亚热带农业研究所实验室保存。原核表达载体pET-29a购自宝生物工程(大连)有限公司。

      Ex Taq DNA聚合酶、PrimeScriptTM Reverse Transcriptase、RNAiso Plus和DNA胶回收试剂盒及质粒提取回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司,引物和测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。

    • 根据已克隆出的Nt3GT的OFR序列[4],设计含有KpnⅠ和SalⅠ酶切位点的特异扩增引物,为GT1:5′-GGG GGT ACC ATG ACC AGC AAA AAT GAC-3′(下划线为KpnⅠ酶切位点),GT2:5′-GGG GTC GAC GAT ATC ATA CTG CAG TCT TC-3′(下划线为SalⅠ酶切位点)。

    • Nt3GT全长cDNA为模板,3GT1和3GT2为引物,PCR扩增Nt3GT OFR序列。PCR扩增条件如下:94℃预变性5min,94℃变性30 s,60℃退火45 s,72℃延伸1 min,30个循环,最后72℃延伸10 min。

      将含有KpnⅠ和SalⅠ酶切位点的Nt3GT OFR和pET29a原核表达载体同时用KpnⅠ和SalⅠ进行双酶切,回收目的基因片段和原核表达载体大片段,并将回收好的大小片段按一定体系用T4-DNA连接酶16℃连接过夜,并将连接产物转化大肠杆菌HB101感受态细胞,涂布于100 mg·L-1氨苄抗性固体LB培养基37℃恒温箱中培养12 h,挑取单克隆进行PCR和双酶切鉴定。

    • 将构建成功的重组质粒pET29a-Nt3GT转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经PCR鉴定后挑取阳性单克隆菌落接种于3 mL含100 mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养过夜。各取上述过夜菌100 μL转入3 mL含100 mg·L-1卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养至OD600=0.6左右时,取出1 mL菌液作为诱导前的电泳样品(作为对照),剩余培养液加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1,继续诱导培养3 h,获得诱导菌液。

      重组蛋白的SDS-PAGE检测:取1mL经诱导的菌液,连同诱导前样品,13 000 r·min-1离心1 min收集菌体,加入Tris-HCl缓冲液悬浮菌体用枪头吹打菌体使菌体重悬,在冰浴中超声波破碎细胞,破碎10 s,间隔10 s,共破碎5 min;收集混合液后4℃,12 000 r·min-1离心15 min,上清和沉淀样品中分别加入凝胶上样缓冲液,100℃水浴变性处理10 min。吸取30 μL加样于14%SDS-PAGE电泳,凝胶用考马斯亮蓝染色。

    • Nt3GT全长cDNA为模板,3GT1和3GT2为引物,PCR扩增Nt3GTOFR序列,扩增产物在1 461 bp出现特异性条带,大小与预期相符。将扩增出来的目的片段用2个酶同时进行双酶切(图 1),回收测序鉴定正确,可用于表达载体的构建。

      图  1  Nt3GT基因的获得

      Figure 1.  Obtaining of Nt3GT gene

    • 将pET29a原核表达载体用KpnⅠ和SalⅠ进行双酶切,回收原核表达载体大片段,与2.1中获得的目的基因的酶切片段连接并转化大肠杆菌HB101感受态细胞,转化成功的菌株挑取单克隆做菌落PCR鉴定(图 2-A),PCR鉴定为阳性的菌落摇菌提取质粒进一步做双酶切鉴定(图 2-B),酶切产物与PCR产物大小一致。将目的条带测序,序列比对结果正确,表明pET29a-Nt3GT原核表达载体构建成功。

      图  2  重组质粒的检测与鉴定

      Figure 2.  PCR detection and identification of recombinant plasmid

    • 将构建好的pET29a-Nt3GT重组子转入表达菌株BL21中,挑取的3个菌斑经PCR检测均为阳性克隆(图 3),表明pET29a-Nt3GT重组子成功转入表达菌株中。进行扩大培养,利用IPTG诱导菌体表达,提取蛋白质进行SDS-PAGE电泳分析(图 4),目的蛋白主要在沉淀中,在大小约55 kDa处出现一较高浓度的诱导表达条带,与预计的重组Nt3GT蛋白大小一致,而未经过IPTG诱导表达的样品在约55 kDa处出现1条很淡的条带,为重组Nt3GT蛋白的基础表达;上清中看不到表达条带,说明表达产物主要以包涵体形式存在,这可能与目的蛋白表达量很高及原核表达通常存在目的蛋白以包涵体的形式表达有关。

      图  3  重组质粒PCR鉴定

      Figure 3.  PCR identification of recombinant plasmid IPTG

      图  4  诱导表达产物的SDS-PAGE检测

      Figure 4.  Detection on product of induced expression by SDS-PAGE

    • pET是目前应用最为广泛的原核表达系统,已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的外源蛋白。外源基因能否在大肠杆菌中正确表达,受到很多因子的影响,如目的基因本身的特性(稀有密码子的多少,是否是跨膜蛋白等)、诱导温度和时间等[10]。本试验中选用的BL21是常用的原核表达菌株,BL21细胞基因组中的T7启动子能够被IPTG诱导,诱导后能够增加其下游基因产物T7 RNA聚合酶的表达,T7 RNA聚合酶又能够使转入BL21细胞中的质粒目的基因转录成mRNA,进而表达为蛋白质[12],而IPTG诱导可以使BL21细胞表达更多目的蛋白质,但获得的蛋白通常以包涵体的形式表达。包涵体蛋白虽然往往无生物活性,需要重新溶解和复性,但包涵体的形成有利于防止蛋白酶对表达蛋白的降解,增加了产物的稳定性,同时包涵体中杂蛋白的含量少,这也为重组蛋白的分离与纯化带来了极大的方便,通过对包涵体的纯化,可得到纯度较高的目的蛋白[13-14]。本研究构建表达载体pET29a-Nt3GT,在37℃、3 h诱导条件下在BL21大肠杆菌中正确表达,并有很高的表达量,以形成包涵体为主。这为后续试验如NT3GT蛋白的纯化、多克隆抗体的制备以及酶活分析等奠定了基础。

参考文献 (14)

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