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水稻OsPLATZ14基因启动子的克隆及表达分析

陈睿 陈建民 吴明基 杨绍华 胡昌泉

引用本文:
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水稻OsPLATZ14基因启动子的克隆及表达分析

    作者简介: 陈睿(1980−),女,硕士,副研究员,研究方向:水稻遗传育种(E-mail:candy_chenrui@163.com
  • 基金项目:

    福建省自然科学基金项目(2017J01055);福建省科技计划项目-省属公益类科研院所基本科研专项(2016R1018-8)

  • 中图分类号: S 511

Cloning and Expression Analysis of OsPLATZ14 Promoter in Rice (Oryza sativa L.)

  • 摘要:   目的  研究pOsPLATZ14的结构及时空表达模式,对深入研究OsPLATZ14基因功能、了解PLATZ转录因子在水稻生长发育进程的作用具有重要意义。  方法  利用BDGP、FPROM及Cister预测分析pOsPLATZ14大小,以水稻日本晴基因DNA为模板扩增pOsPLATZ14;应用PlantCARE分析序列中的顺序作用元件,构建pOsPLATZ14::GUS载体,转化水稻获得转基因植株;通过GUS组织化学染色法分析pOsPLATZ14在水稻中的时空表达特征。  结果  经PCR扩增获得pOsPLATZ14长度为1 899 bp,该区域含有光信号、逆境响应及激素应答等多种顺式作用元件。pOsPLATZ14驱动的GUS报告基因在水稻种子萌发期,苗期根、茎、叶,抽穗期的根、茎、叶、花穗、小花、叶夹角、茎结合部位、根茎过渡区及成熟期种子均有明显表达。  结论  pOsPLATZ14为组成型启动子,其下游调控基因OsPLATZ14可能在水稻生长发育过程中起重要作用。
  • 图 1  表达载体pOsPLATZ14::GUS示意图

    Fig. 1  The schematic diagram of construct pOsPLATZ14::GUS

    图 2  pOsPLATZ14启动子扩增片段电泳图

    Fig. 2  Electrophoretogram of promoter pOsPLATZ14 amplified fragment.

    图 3  重组质粒pOsPLATZ14::GUS酶切验证

    Fig. 3  The recombinant plasmid digested by restriction enzymes

    图 4  转基因水稻T0代PCR检测

    Fig. 4  PCR analysis of genome DNA of T0 transgenic rice plant

    图 5  pOsPLATZ14::GUS转基因水稻的组织化学染色

    Fig. 5  Histochemical staining of pOsPLATZ14::GUS transgenic rice

    表 1  OsPLATZ14基因启动子序列顺式作用元件

    Table 1  The cis-acting elements in promoter sequence of OsPLATZ14

    位点名称 Site name 信号序列 Signal Sequence 数量 Amount 位点功能 Function of Site
    TATA-box ATATAA/ TATA 2 主要顺式调控元件 Common cis-acting elements
    CAAT-box CAAT/CCAAT/ CAAAT 10 主要顺式调控元件 Common cis-acting elements
    3-AF1 binding site TAAGAGAGGAA 1 光响应元件 Light response element
    GATA-motif GATAGGA 1 光响应元件 Light response element
    Sp1 GGGCGG 1 光响应元件 Light response element
    MRE AACCTAA 1 光响应元件 Light response element
    ARE AAACCA 2 缺氧胁迫响应元件 Anaerobic stress response element
    MBS CAACTG 1 干旱胁迫响应元件 Drought stress response element
    CAT-box GCCACT 1 分生组织特异性元件 Meristem expression element
    ABRE ACGTG 1 脱落酸响应元件 abscisic acid response element
    P-box CCTTTTG 1 赤霉素响应元件 Gibberellin response element
    TCA-element TCAGAAGAGG 1 水杨酸响应元件 Salicylic acid response element
    TGA-element AACGAC 1 生长素响应元件 Auxin response element
    TGACG-motif TGACG 1 茉莉酸响应元件 MeJA response element
    CCAAT-box CAACGG 1 MYB结合位点 MYB binding site
    AAGAA-motif GAAAGAA 3 功能未知元件 Function unknown component
    ERE ATTTCATA 1 功能未知元件 Function unknown component
    MYB CAACCA 1 功能未知元件 Function unknown component
    MYC CATTTG 3 功能未知元件 Function unknown component
    Myb CAACTG 1 功能未知元件 Function unknown component
    STRE AGGGG 2 功能未知元件 Function unknown component
    TATA TATAAAAT 1 功能未知元件 Function unknown component
    TCA TCATCTTCAT 1 功能未知元件 Function unknown component
    Unnamed__1 CGTGG 1 功能未知元件 Function unknown component
    Unnamed__4 CTCC 11 功能未知元件 Function unknown component
    WUN-motif AAATTACT 1 功能未知元件 Function unknown component
    as-1 TGACG 1 功能未知元件 Function unknown component
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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2019-09-18
  • 修改稿:  2019-10-18

水稻OsPLATZ14基因启动子的克隆及表达分析

    作者简介: 陈睿(1980−),女,硕士,副研究员,研究方向:水稻遗传育种(E-mail:candy_chenrui@163.com
  • 1. 福建省农业科学院生物技术研究所,福建 福州 350003
  • 2. 福建省农业遗传工程重点实验室,福建 福州 350003

摘要:   目的  研究pOsPLATZ14的结构及时空表达模式,对深入研究OsPLATZ14基因功能、了解PLATZ转录因子在水稻生长发育进程的作用具有重要意义。  方法  利用BDGP、FPROM及Cister预测分析pOsPLATZ14大小,以水稻日本晴基因DNA为模板扩增pOsPLATZ14;应用PlantCARE分析序列中的顺序作用元件,构建pOsPLATZ14::GUS载体,转化水稻获得转基因植株;通过GUS组织化学染色法分析pOsPLATZ14在水稻中的时空表达特征。  结果  经PCR扩增获得pOsPLATZ14长度为1 899 bp,该区域含有光信号、逆境响应及激素应答等多种顺式作用元件。pOsPLATZ14驱动的GUS报告基因在水稻种子萌发期,苗期根、茎、叶,抽穗期的根、茎、叶、花穗、小花、叶夹角、茎结合部位、根茎过渡区及成熟期种子均有明显表达。  结论  pOsPLATZ14为组成型启动子,其下游调控基因OsPLATZ14可能在水稻生长发育过程中起重要作用。

English Abstract

    • 【研究意义】PLATZ(又称PLATZ1,plant AT-rich sequence and zinc-binding protein 1)是一种新型植物特异性锌依赖的转录因子[1-3],在植物次生代谢、应激反应以及特定细胞类型的识别等特有的过程中发挥着重要作用[4]。水稻作为单子叶植物模式植物及重要的粮食作物,拥有15个PLATZ基因(http://plntfdb.bio.uni-potsdam.de/v3.0/fam_mem.php?family_id=PLATZ&sp_id=OSAI),然而该类基因如何参与水稻生长发育的进程却知之甚少[2],研究PLATZ转录因子的功能及调控模式,加深了解该类基因的研究具有重要意义。【前人研究进展】PLATZ家族蛋白长度约82个氨基酸,包括C-X2-H-X11-C-X2-C-X(4-5)-C-X2-C-X(3-7)-H-X2-H和C-X2-C-X(10-11)-C-X3-C两个主要分区的保守PLATZ结构域,广泛分布于双子叶植物、单子叶植物、苔藓和藻类中[3]。至今为止,仅有少数PLATZ基因的功能已知。PLATZ转录因子首次由Nagano等于2001年从豌豆中分离,非特异地结合到富含A/T序列且负向调控基因petE的增强子[1]。Hyun-A等2015年从大豆中分离出AtPLATZ1基因,亚细胞定位于细胞核且参与渗透胁迫条件下种子发芽过程[5]。Gonzalez-Morales等2016年利用T-DNA插入敲除AtPLATZ1AtPLATZ2基因功能,证实这两基因的表达可提高种子干燥耐受性,在种子干燥耐受性中发挥重要作用[6]。Li等2017年克隆和功能解析了FL3ZmPLATZ12)基因,该基因在胚乳淀粉细胞中特异表达,与RNAPIII两个关键亚基RPC53和TFC1相互作用,参与tRNA和5S rRNA转录调控,从而调控胚乳发育和储存物质合成[7]。Wang等2018年鉴定并克隆了玉米基因组中的17个PLATZ基因,所有ZmPLATZs均位于细胞核内,普遍参与了RNA聚合酶III(RNAPIII)介导的小分子非编码RNA转录的调控[3]。Kim等2018年在拟南芥中克隆新AtPLATZ基因ORESARA15,其通过促进早期细胞增殖的速度和持续时间来促进叶片生长,通过GRF/GIF调节通路来抑制后期叶片衰老[8]。Wang等2019年图位克隆并功能鉴定了水稻中的第一个PLATZ基因GL6,该基因通过与rpc53和tfc1相互作用,参与RNA聚合酶III转录机制,促进幼穗和谷粒的细胞增殖,对谷粒长度起到积极的控制作用[2]。【本研究切入点】截至目前,水稻尚有14个PLATZ基因功能未知。本文选取OsPLATZ14,从基因启动子的时空表达模式入手解析该基因的功能。启动子是转录水平调控的重要顺式作用元件,研究OsPLATZ14基因的结构及功能将有助于了解该基因在水稻生长发育的作用。【拟解决的关键问题】本研究通过构建OsPLATZ14启动子与GUS报告基因的融合表达载体pOsPLATZ14,利用农杆菌介导法转入野生型日本晴获得转基因植株。通过GUS组织化学染色分析该基因的时空表达特性,旨在为进一步研究OsPLATZ14在水稻生长与发育中的功能奠定基础。

    • 供试材料为粳稻品种日本晴(O. sativa L. spp. japonica),植物表达载体pCAMBIA1305.1,农杆菌菌株EHA105均为本实验室保存。

      PrimeSTAR®HS DNA Polymerase with GC Buffer、BamHI、NcoI、T4 DNA Ligase购自宝日医生物技术(北京)有限公司Takara中国;Zero Background pTOPO-Blunt Simple Cloning Kit零背景pTOPO-Blunt Simple平末端克隆试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司;普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DH5α感受态细胞、Golden Fast PCR Kit购自天根生化科技(北京)有限公司;GUS染色试剂盒购自Biosharp Life sciences;引物合成及测序由福州擎科生物技术有限公司完成。

    • 通过NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下载OsPLATZ14(LOC_Os10g42410)基因CDS区域ATG上游序列2 000 bp,应用BDGP(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)、FPROM(http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fprom&group=programs&subgroup=promoter)、Cister(https://zlab.bu.edu/~mfrith/cister.shtml)预测基因启动子的长度,PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析基因启动子的顺式调控元件。

    • 根据预测结果及表达载体pCAMBIA1305.1插入位置的酶切位点设计特异PCR引物,pOsPLATZ14-F: 5’-AGCAGGATCCAGTTGGATACAGACTGACAGAGGAGAG-3’(下划线为限制性内切酶BamHI的酶切位点),pOsPLATZ14-R: 5’-AGCACCATGGTCAATCAATCAGTCCTCTCCTCTCC-3’(下划线为限制性内切酶NcoI的酶切位点),产物大小为1 899 bp。

      采用CTAB法提取水稻日本晴基因组DNA,PCR扩增OsPLATZ14启动子(pOsPLATZ14)。PCR反应体系50 μL:2×PrimeSTAR GC Buffer(Mg2+ plus)25 μL,dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1 each)4 μL,10 pmol·μL-1上下游引物各1.5 μL,Template DNA 1.5 μL,PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U·μL-1)0.5 μL,ddH2O 16 μL。PCR反应程序:98℃预变性3 min;98℃变性15 s,58℃退火30 s,72℃延伸2 min,共30个循环;72℃延伸8 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离,切胶回收连接至pTOPO-Blunt Simple载体,热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆,M13F/M13R通用引物进行PCR扩增,选取正确片段大小的阳性质粒pTOPO-pOsPLATZ14测序。

    • 将质粒pOsPLATZ14及表达载体pCAMBIA1305.1质粒同时进行BamHI、NcoI双酶切。酶切产物在1%琼脂糖凝胶电泳分离并切胶回收,用T4 DNA Ligase于16℃反应12 h。将连接产物热击转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑选阳性菌落进行PCR鉴定。PCR引物:pOsPLATZ14::GUS-F:5'-AAAGAAGGAAGGAGTTGGACGA-3'(位于启动子区);pOsPLATZ14::GUS-R:5'- GTCATTGTAACTGCTTGGGACG -3'(位于载体区);大小为655 bp。PCR反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,58℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸8 min。选取正确片段大小的阳性质粒用BamHI、NcoI双酶切。将酶切正确大小的pOsPLATZ14::GUS载体质粒(图1)电击转化农杆菌EHA105感受态细胞,利用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻愈伤组织[9]

      图  1  表达载体pOsPLATZ14::GUS示意图

      Figure 1.  The schematic diagram of construct pOsPLATZ14::GUS

    • 取T0代转基因水稻叶片提取DNA,利用pOsPLATZ14::GUS-F/R引物鉴定阳性植株。在水稻萌发6 d、三叶期、开花期及灌浆期,分别取植株不同组织按照GUS染色试剂盒说明进行染色过夜,用75%乙醇脱色2-3次,至完全脱色后,将材料置于显微镜或Bio-5000 Plus中晶扫描仪观察拍照。

    • 利用BDGP、FPROM及Cister预测分析OsPLATZ14基因的启动子大小。BDGP预测显示Promoter Sequence位于1 805-1 855 bp处(Score = 0.99);FPROM预测显示Promoter POS.位于1 842 bp,TATA-box(GATAAAAG)始于1 815 bp处;Cister分析显示启动子主要顺式调控元件TATA-box位于1 814-1 828 bp;综合3种不同预测软件分析结果表明,截取pOsPLATZ14大小约为1 855 bp。根据预测结果设计特异PCR引物扩增pOsPLATZ14序列长度为1 899 bp。

      通过PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)对pOsPLATZ14进行顺序调控元件分析,发现该序列中包括7种启动子中常有的顺式作用元件(表1)。第一类是启动子的主要顺式作用元件:TATA-box 2个,CAAT-box 10个;第二类是光响应作用元件:3-AF1 binding site 1个,GATA-motif 1个,Sp1 1个,MRE 1个;第三类是受环境胁迫调控的相关元件:缺氧胁迫相关ARE 2 个,干旱胁迫相关MBS 1 个;第四类是分生组织特异性元件:CAT-box 1个;第五类是植物激素响应元件:脱落酸响应相关ABRE 1个,赤霉素响应相关P-box 1个,水杨酸响应相关TCA-element 1个,生长素响应相关TGA-element 1个,茉莉酸响应相关TGACG-motif 1个;第六类是蛋白结合位点相关元件:MYB结合位点CCAAT-box 1个;第七类是功能未知的元件:AAGAA-motif 3个,ERE 1个,MYB 1个,MYC 3个,Myb 1个,STRE 2个,TATA 1个,TCA 1个,Unnamed_1 1个,Unnamed_4 11个,WUN-motif 1个,as-1 1个。分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,OsPLATZ14可能参与水稻生长发育过程中光信号响应、环境胁迫应答、分生组织激活以及激素调节。

      表 1  OsPLATZ14基因启动子序列顺式作用元件

      Table 1.  The cis-acting elements in promoter sequence of OsPLATZ14

      位点名称 Site name 信号序列 Signal Sequence 数量 Amount 位点功能 Function of Site
      TATA-box ATATAA/ TATA 2 主要顺式调控元件 Common cis-acting elements
      CAAT-box CAAT/CCAAT/ CAAAT 10 主要顺式调控元件 Common cis-acting elements
      3-AF1 binding site TAAGAGAGGAA 1 光响应元件 Light response element
      GATA-motif GATAGGA 1 光响应元件 Light response element
      Sp1 GGGCGG 1 光响应元件 Light response element
      MRE AACCTAA 1 光响应元件 Light response element
      ARE AAACCA 2 缺氧胁迫响应元件 Anaerobic stress response element
      MBS CAACTG 1 干旱胁迫响应元件 Drought stress response element
      CAT-box GCCACT 1 分生组织特异性元件 Meristem expression element
      ABRE ACGTG 1 脱落酸响应元件 abscisic acid response element
      P-box CCTTTTG 1 赤霉素响应元件 Gibberellin response element
      TCA-element TCAGAAGAGG 1 水杨酸响应元件 Salicylic acid response element
      TGA-element AACGAC 1 生长素响应元件 Auxin response element
      TGACG-motif TGACG 1 茉莉酸响应元件 MeJA response element
      CCAAT-box CAACGG 1 MYB结合位点 MYB binding site
      AAGAA-motif GAAAGAA 3 功能未知元件 Function unknown component
      ERE ATTTCATA 1 功能未知元件 Function unknown component
      MYB CAACCA 1 功能未知元件 Function unknown component
      MYC CATTTG 3 功能未知元件 Function unknown component
      Myb CAACTG 1 功能未知元件 Function unknown component
      STRE AGGGG 2 功能未知元件 Function unknown component
      TATA TATAAAAT 1 功能未知元件 Function unknown component
      TCA TCATCTTCAT 1 功能未知元件 Function unknown component
      Unnamed__1 CGTGG 1 功能未知元件 Function unknown component
      Unnamed__4 CTCC 11 功能未知元件 Function unknown component
      WUN-motif AAATTACT 1 功能未知元件 Function unknown component
      as-1 TGACG 1 功能未知元件 Function unknown component
    • 以日本晴基因组DNA为模板,用pOsPLATZ14-F/R扩增pOsPLATZ14,电泳检测结果显示扩增与预期目的片段大小相符(图2)。回收纯化PCR产物连接至pTOPO-Blunt Simple载体,挑选阳性克隆测序,测序结果经NCBI数据库比对正确,表明pOsLATZ14扩增成功。BamHI、NcoI双酶切pTOPO-pOsPLATZ14及表达载体pCAMBIA1305.1,产物回收连接转化,PCR筛选阳性质粒且BamHI、NcoI双酶切正确(图3),表明pOsPLATZ14::GUS表达载体构建成功。

      图  2  pOsPLATZ14启动子扩增片段电泳图

      Figure 2.  Electrophoretogram of promoter pOsPLATZ14 amplified fragment.

      图  3  重组质粒pOsPLATZ14::GUS酶切验证

      Figure 3.  The recombinant plasmid digested by restriction enzymes

    • 通过农杆菌介导遗传转化获60个T0代转基因水稻株系。取转基因水稻叶片提取DNA,利用特异引物性pOsPLATZ14::GUS-F/R对目的条带进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测,共获得45个GUS转基因株系。阳性植株扩增出655 bp特异性片段,与质粒对照大小相符,阴性植株且日本晴均未扩增出相应片段(图4),表明pOsPLATZ14::GUS载体已成功转入水稻植株。

      图  4  转基因水稻T0代PCR检测

      Figure 4.  PCR analysis of genome DNA of T0 transgenic rice plant

    • 以日本晴为阴性对照,同时取10个T0代阳性转基因株系及其收种后萌发进行GUS组织化学染色分析。分别取种子萌发期,苗期根、茎、叶,抽穗期的根、茎、叶、花穗、小花、叶夹角、茎结合部位、根茎过渡区及成熟期种子进行GUS染色,通过组织化学染色法分析OsPLATZ14启动子在水稻中的时空表达特征(图5)。结果显示种子的萌发期、幼苗的营养生长期及生殖生长期,转基因植株各部分均可见GUS活性的明显蓝色,表明pOsPLATZ14在水稻各组织中具有组成型的表达模式。

      图  5  pOsPLATZ14::GUS转基因水稻的组织化学染色

      Figure 5.  Histochemical staining of pOsPLATZ14::GUS transgenic rice

    • 基因功能分析是生物学热点研究内容。启动子是基因表达的重要顺式作用元件,研究启动子的结构及其时空表达模式,有助于了解其下游调控基因的表达模式及调控机制[10-12]。近年来启动子分析成为开展基因功能研究的有效途径之一[13-18]。启动子是位于基因5’端上游的DNA序列,目前主要采用生物信息学对目的片段进行预测,常用的分析预测软件如Primer-BLAST、Softberry系列工具、Promoter 2.0、BDGP、Cister、Match及AliBaba 2.1等。如何截取合理的长度用于研究,需要综合多个预测软件结果。本研究利用BDGP、FPROM及Cister等3个预测平台分析OsPLATZ14基因启动子长度约1 855 bp,结合特异PCR引物扩增最终确定pOsPLATZ14长度为1 899 bp。

      通过PlantCARE分析pOsPLATZ14结构,发现该片段中含有确保下游调控基因转录的RNAPII核心启动子元件TATA-box和CAAT-box之外,还包含多种与植物生长发育、节律调控、逆境胁迫及激素响应元件,其中响应光信号4类、逆境胁迫2类、激素响应5类,暗示该基因可能参与水稻的发育、代谢和对逆境胁迫响应等多种生理过程。pOsPLATZ14驱动的GUS基因的表达模式显示在水稻整个生长过程的各组织中具有较强驱动力,表明OsPLATZ14参与水稻的生长发育全过程。

      Wang等鉴定了水稻和拟南芥中所有的PLATZ成员,并构建了玉米ZmPLATZ的最大似然系统发育树,分析显示OsPLATZ14ZmPLATZ3ZmPLATZ13同源性高,暗示可能对植物的生长发育具有共同的作用。通过酵母双杂交试验确定ZmPLATZ3与RNAPIII转录复合物中的两个关键因子RPC53和TFC1相结合,ZmPLATZ13与RNAPIII转录复合物中的关键因子TFC1相结合,表明ZmPLATZ3ZmPLATZ13参与RNAPIII介导的转录调节[3]。RNAPIII转录复合物负责小分子RNA的转录,包括tRNA、5S rRNA、7SL RNA、RNase P和其他小非编码RNA,调控RNA和多种细胞发育过程的蛋白质合成[19-20]。由此推测OsPLATZ14极有可能具有类似功能,在水稻的生长发育中发挥重要的作用。后续研究将利用CRISPR/CAS9及酵母双杂等技术研究该基因在水稻生长发育中的功能,以进一步了解PLATZ转录因子家族对水稻的调控机理。

参考文献 (20)

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