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西花蓟马不同RNA干扰技术比较研究

李恒 周知恩 陈勇 陆承聪 张祥琴 王谅 陈艺欣 田厚军 林硕 张洁 游泳 魏辉

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西花蓟马不同RNA干扰技术比较研究

    作者简介: 李恒(1993−),女,硕士研究生,研究方向:昆虫生态与害虫综合治理(E-mail:592995627@qq.com
    通讯作者: 魏辉(1972−),男,博士,研究员,研究方向:昆虫化学生态学(E-mail:weihui@faas.cn
  • 基金项目:

    国家重点研发计划项目(2018YFD0201102;2018YFD0201209);国家自然科学基金项目(31871936、31560499);福建省科技重大专项(2017NZ0003-1-4);福建省科技计划项目——省属公益类基本科研专项(2017R1025-9、2018R1025-7、2019R1024-2、2019R1024-3);福建省农业科学院科技项目(STIT2017-3-2、AGY2018-5、AC2017-6、YC2019003);云南省应用基础研究计划面上项目(2016FB063);云南省应用基础研究计划重点项目(2018FA020);云南省中青年学术技术带头人后备人才项目(2015HB081)

  • 中图分类号: S433.89

Comparative study on RNA interference system in Frankliniella occidentalis

  • 摘要:   目的  西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种重要的外来入侵害虫,其繁殖能力强、寄主范围广、抗药性强,给我国蔬菜、花卉等经济作物造成了严重危害。本研究旨在评估膜饲喂和显微注射dsActin对西花蓟马Actin基因的沉默效率,以期为蓟马类等小型昆虫基因功能的研究提供方法和依据。  方法  通过膜饲喂和显微注射的方法将体外合成的dsActin导入西花蓟马二龄若虫体内,用RT-qPCR方法检测Actin基因的mRNA表达;通过单头饲养方法观察统计西花蓟马成虫体长、成虫翅膀或胸腹部畸形率及死亡率。  结果  dsActin膜饲喂后24 、48、72 h,Actin基因的相对表达量分别为对照组的97%、91%和98%;通过显微注射将dsActin注入西花蓟马体腔,在注射后24、48、72 h,Actin基因的表达量分别为对照组的68%、56%和53%。注射dsActin的西花蓟马在第1-5 d死亡率为44%-98%,显著高于dsGFP对照组;此外,dsActin组个体体长仅为dsGFP对照组的90%,且翅膀或胸腹部出现畸形率为41%。  结论  显微注射dsActin能显著沉默西花蓟马Actin基因mRNA水平的表达,并引起西花蓟马个体不正常发育和死亡,从而建立蓟马类小型昆虫RNAi体系。
  • 图 1  西花蓟马Actin基因的RT-PCR产物

    Fig. 1  RT-PCR products of Actin gene of Frankliniellaoccidentalis

    图 2  西花蓟马Actin基因核酸序列和预测的氨基酸序列

    Fig. 2  Nucleotide and predicted amino acid sequences of Actin genes of Frankliniellaoccidentalis.

    图 3  dsRNA在饲喂过程中的稳定性

    Fig. 3  The stability of dsRNA in membrane feeding

    图 4  dsRNA对西花蓟马Actin相对表达量的影响

    Fig. 4  The repression of Actin genes by treatment with dsRNA

    图 5  dsRNA对西花蓟马死亡率及生长发育的影响

    Fig. 5  Effects of dsRNA (0.5 μg·μL-1) on the growth and mortality rate of Frankliniella occidentalis

    表 1  引物信息

    Table 1  Primers used in this study

    引物名称引物序列(5'-3')
    Actin/F ATGTGTGACGACGATGTTGC
    Actin/R TTAGAAGCACTTGCGGTGGACG
    T7Actin/F TAATACGACTCACTATAGGGTTCGTGGGCATGGAATC
    TTGCGGTAT
    T7Actin/R TAATACGACTCACTATAGGGCGGACTCGTCGTACTCG
    TCCTTGGAGA
    T7GFP/F TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGAGCTGTTCACC
    GG
    T7GFP/R TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGG
    q18S/F TTTTATGGTGGTGTTGTTGTGG
    q18S/R CAAGGGCTTTGGGTAATGG
    q Actin /F TGGTCGGTATGGGACAGAAGGA
    qActin/R TCGGTGAGCAGGACAGGGTG
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出版历程
    收稿日期: 
  • 初稿:  2019-08-28
  • 修改稿:  2019-09-29

西花蓟马不同RNA干扰技术比较研究

    通讯作者: 魏辉, weihui@faas.cn
    作者简介: 李恒(1993−),女,硕士研究生,研究方向:昆虫生态与害虫综合治理(E-mail:592995627@qq.com
  • 1. 福建农林大学闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室,福建 福州 350002
  • 2. 福建省农业科学院植物保护研究所/福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/农业部福州作物有害生物科学观测试验站,福建 福州 350003
  • 3. 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所/云南省农业生物技术重点实验室/农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室,云南 昆明 650223

摘要:   目的  西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)是一种重要的外来入侵害虫,其繁殖能力强、寄主范围广、抗药性强,给我国蔬菜、花卉等经济作物造成了严重危害。本研究旨在评估膜饲喂和显微注射dsActin对西花蓟马Actin基因的沉默效率,以期为蓟马类等小型昆虫基因功能的研究提供方法和依据。  方法  通过膜饲喂和显微注射的方法将体外合成的dsActin导入西花蓟马二龄若虫体内,用RT-qPCR方法检测Actin基因的mRNA表达;通过单头饲养方法观察统计西花蓟马成虫体长、成虫翅膀或胸腹部畸形率及死亡率。  结果  dsActin膜饲喂后24 、48、72 h,Actin基因的相对表达量分别为对照组的97%、91%和98%;通过显微注射将dsActin注入西花蓟马体腔,在注射后24、48、72 h,Actin基因的表达量分别为对照组的68%、56%和53%。注射dsActin的西花蓟马在第1-5 d死亡率为44%-98%,显著高于dsGFP对照组;此外,dsActin组个体体长仅为dsGFP对照组的90%,且翅膀或胸腹部出现畸形率为41%。  结论  显微注射dsActin能显著沉默西花蓟马Actin基因mRNA水平的表达,并引起西花蓟马个体不正常发育和死亡,从而建立蓟马类小型昆虫RNAi体系。

English Abstract

    • 【研究意义】RNA干扰(RAN interference, RNAi)技术广泛应用于动物、植物和微生物等基因功能的研究。利用转基因技术在植物体表达dsRNA,当昆虫取食带有dsRNA的植物,dsRNA随食物进入到昆虫体内,使昆虫某些功能丧失造成损伤或者死亡,从而达到防治害虫的效果。利用RNAi防治害虫的设想已经在鳞翅目和鞘翅目昆虫上实现[1-2]。西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是一种危险的入侵害虫,对蔬菜和观赏性植物危害严重,并且其传播的番茄斑萎病毒对寄主植物造成重大损失[3]。西花蓟马虫体小,隐蔽性强,目前常用的防治方法很难有效控制。因此,建立快速有效的西花蓟马RNA干扰技术,对研究西花蓟马的基因功能以及防治蓟马类害虫有重要意义。【前人研究进展】目前将外源dsRNA导入昆虫体内的方式有很多,如饲喂法、注射法、浸泡法、转基因植物表达后昆虫取食等,但是饲喂法和注射法是最常用的两种方法。对于有些昆虫,采用饲喂和注射两种方法都取得较好效果。如烟粉虱通过饲喂dsRNA和显微注射伪蛹和成虫都能有效抑制靶基因的表达[4-5];以Pxbursα部分序列的双链RNA(dsRNA)饲喂小菜蛾4龄末期幼虫,发现蛹期Pxbursα的表达受到了显著抑制,小菜蛾的发育停滞在蛹期而无法正常羽化,并最终死亡;利用合成的VgR siRNA注射小菜蛾雌蛹,结果显示16 h内VgR的表达受到明显抑制,证明RNAi对小菜蛾有效[6-7]。饲喂法也在桔小实蝇[8]、柑橘全爪螨[9]、褐飞虱[10]、白背飞虱[11]等昆虫上成功应用,注射法在桔小实蝇[12]、柞蚕[13]、中华按蚊[14]、豌豆长管蚜[15]等昆虫上行之有效。但对有些昆虫饲喂法没有效果,如喂食黑腹果蝇表达dsRNA的酵母没有获得成功[16];饲喂法也不能有效沉默东亚飞蝗V-ATPase A/ECHS1、Kr-h1Verm基因的表达[17]。应用RNAi抑制害虫靶基因表达在害虫防治中表现出巨大潜力,目前在刺吸式口器的同翅目昆虫蚜虫、叶蝉和粉虱防治上都已得到应用[18]。【本研究切入点】国内外对西花蓟马RNAi的研究成熟经验很少[19],国内没有关于蓟马RNAi的研究。【拟解决的关键问题】本研究选用膜饲喂法和显微注射法干扰西花蓟马的Actin基因,明确蓟马RNAi干扰的合适方法,为小型昆虫基因功能的研究和验证提供依据。

    • 西花蓟马由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供,用四季豆饲养于人工气候箱(MGC-350HP-2,上海一恒科技有限公司)。饲养条件为温度25℃,相对湿度60%~70%,光照LD = 1410 h。

    • 根据NCBI西花蓟马Actin基因序列(GenBank登录号:XM_026432071.1)设计Actin引物(表1)。西花蓟马总RNA的提取采用Trizol(Ambion公司)法,然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)反转成cDNA[20]。再以西花蓟马cDNA为模板扩增Actin基因[20],PCR产物回收纯化(TransGen Biotech, catalog number: DP209)后连接到T载体上,挑选单菌落进行PCR鉴定,并送上海铂尚生物技术有限公司测序。

      表 1  引物信息

      Table 1.  Primers used in this study

      引物名称引物序列(5'-3')
      Actin/F ATGTGTGACGACGATGTTGC
      Actin/R TTAGAAGCACTTGCGGTGGACG
      T7Actin/F TAATACGACTCACTATAGGGTTCGTGGGCATGGAATC
      TTGCGGTAT
      T7Actin/R TAATACGACTCACTATAGGGCGGACTCGTCGTACTCG
      TCCTTGGAGA
      T7GFP/F TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGAGCTGTTCACC
      GG
      T7GFP/R TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGG
      q18S/F TTTTATGGTGGTGTTGTTGTGG
      q18S/R CAAGGGCTTTGGGTAATGG
      q Actin /F TGGTCGGTATGGGACAGAAGGA
      qActin/R TCGGTGAGCAGGACAGGGTG
    • 根据已扩增验证的西花蓟马Actin基因序列设计合成dsRNA引物,然后在引物的5'端加上T7启动子序列(表1)。用HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs,美国)先扩增5'端均含有T7启动子序列的DNA片段,随后以获得的DNA片段为模板,用T7转录酶进行体外转录以合成目的基因的dsRNA[21],用琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的质量、紫外分光光度计检测浓度,合成的dsRNA置于-80 ℃备用。

    • 为了保证dsRNA在膜饲喂和注射过程中的完整性,先将dsRNA分别置于室温12 h和24 h,然后通过凝胶电泳检测dsRNA的降解情况。

    • 首先将一块小Parafilm拉伸至很薄覆盖在直径约30 mm的饲喂装置上,Parafilm膜的厚薄程度要保证蓟马可以刺破取食液体。在第一层膜上添加饲喂液体50 µL(20%蜂蜜水dsRNA = 11,dsRNA质量浓度为0.5 µg·µL−1[11]),再覆盖上第二层膜以保护液体不挥发和不受污染,第二层膜上放上四季豆以吸引蓟马到膜附近取食。然后分别将100只蜕皮12 h的二龄西花蓟马若虫放置于膜饲喂装置,每隔24 h重新更换dsActin。同时对照组饲喂dsGFP。24 h、48 h 和72 h后各取20只活的西花蓟马检测dsRNA的沉默效果。试验重复3次。

    • 利用油压式手动微量注射仪(CellTramoil, Eppendorf)将质量浓度为0.5 µg·µL−1的dsActin和dsGFP分别注射到200只蜕皮12 h的2龄西花蓟马若虫体腔。注射后24、48、72 h分别取出20只活虫检测dsRNA的沉默效果。另外,在注射后12 h,取30只活虫,单头饲养于放置四季豆的饲养管中,每天观察存活情况和形态变化,共观察5 d,统计死亡率、体长和畸形率。同时,羽化后12 h在体视镜(型号DMSZ7)下测量体长。试验重复3次。

    • Trizol法提取西花蓟马的总RNA,然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒(北京全式金生物科技有限公司)反转录为cDNA。以西花蓟马18S rRNA(GenBank登录号:XM_026420069.1)作为内参基因,分别设计RT-qPCR引物(表1)。参照GoTaq® qPCR Master Mix (2X)试剂盒(Promega公司,美国)操作说明配制反应体系,每个样品设3个重复,在BIO-RAD CFX96实时定量PCR仪(Bio-Rad,美国)检测目标基因的表达量。获得的CT值利用2−△△CT计算目的基因的相对表达水平[11]

    • 不同干扰时间dsRNA处理之间的多重比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA, Tukey HSD test)(SPSS 21.0),差异显著性检验水平标准P<0.05。

    • 根据NCBI上西花蓟马的Actin序列(GenBank登录号:XM_026432071.1)设计引物,PCR扩增及测序结果表明,Actin基因完整的开放性阅读框长度为1 131 bp,编码376个氨基酸(图1-2),与已经报道的西花蓟马Actin基因序列一致。

      图  1  西花蓟马Actin基因的RT-PCR产物

      Figure 1.  RT-PCR products of Actin gene of Frankliniellaoccidentalis

      图  2  西花蓟马Actin基因核酸序列和预测的氨基酸序列

      Figure 2.  Nucleotide and predicted amino acid sequences of Actin genes of Frankliniellaoccidentalis.

    • 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,dsRNA放置24 h后仍然保持较好的完整性(图3)。因此膜饲喂进入蓟马体内的dsRNA是完整的。

      图  3  dsRNA在饲喂过程中的稳定性

      Figure 3.  The stability of dsRNA in membrane feeding

    • RT-qPCR检测结果表明,与对照组饲喂dsGFP相比,膜饲喂dsActin24 h、48 h和72 h后,Actin基因的相对表达量分别为对照组的97%、91%和98%,这表明通过膜饲喂dsActin对西花蓟马Actin基因表达抑制作用不显著(图4)。相反,通过显微注射将dsActin注入西花蓟马体腔,在注射后24 h、48 h和72 h,Actin基因的表达量分别为对照组的68%、56%和53%(图5),与对照组均有显著差异(P<0.05)。

      图  4  dsRNA对西花蓟马Actin相对表达量的影响

      Figure 4.  The repression of Actin genes by treatment with dsRNA

      图  5  dsRNA对西花蓟马死亡率及生长发育的影响

      Figure 5.  Effects of dsRNA (0.5 μg·μL-1) on the growth and mortality rate of Frankliniella occidentalis

    • 由2.3可知,显微注射质量浓度为0.5 µg·μL−1的dsActin可显著抑制西花蓟马Actin基因的表达,观察发现,注射dsGFP的西花蓟马在第1-5 d后的死亡率为29%-52%,而注射dsActin基因的西花蓟马死亡率在第1-5 d达44%-98%(图5-A);同时,注射dsActin的西花蓟马成虫翅膀或胸腹部畸形率为41%(图5-B~C),且个体体长只有注射dsGFP的对照组的90%左右(图5-D)。说明注射dsActin成功干扰了西花蓟马的Actin基因,并对其生长发育产生了影响。

    • RNA干扰是由双链RNA介导、引起目的基因mRNA序列特异性降解的基因沉默的一个过程。通过RNAi沉默靶标基因是当前研究昆虫基因功能的重要手段[22]。饲喂法、注射法、浸泡法、直接取食转基因植物等是将外源dsRNA导入昆虫体内的常用方式[11,22]。已有研究表明,饲喂dsRNA的干扰效率明显低于将其注射到昆虫体腔,如在棉铃虫的RNAi试验中,仅饲喂一次很难产生明显的RNAi效应,连续饲喂才与注射一次的RNAi效果相当[23]。本研究通过比较膜饲喂和微针注射dsActin两种方式沉默西花蓟马Actin基因,结果表明,微针注射方式成功实现了对目的基因的干扰;尽管通过增加膜饲喂次数来增加摄入昆虫体内dsRNA的量,但是72 h后仍然不能有效沉默目的基因。因此,微针注射dsRNA是沉默西花蓟马目的基因的有效方式,该结果为后续西花蓟马及小型昆虫基因功能的研究提供了技术手段。

      基于注射法的RNAi干扰方法能减小昆虫表皮或者中肠障碍,使dsRNA快速进入体腔或者血淋巴,同时还能准确控制进入虫体的dsRNA剂量[12]。本研究表明,显微注射方式虽然具有干扰效果好的优点,但是注射会对昆虫造成直接的物理损伤,增加昆虫死亡率。因此,在注射时要选择合适的针头、注射体积、注射位置,尽量避免损伤昆虫。此外,显微注射前较常用的麻醉方法有乙醚麻醉法、二氧化碳麻醉法和冰冻麻醉法等,选择合适的麻醉方法能降低昆虫死亡率。本研究发现在蓟马麻醉过程中,二氧化碳麻醉法具有速度快、损伤小的优点。

      综上所述,显微注射dsRNA是沉默蓟马目的基因的有效方式,适于开展蓟马类小型昆虫基因功能分析,筛选防控靶标基因,同时在应用过程中,还需要综合考虑各种因素,从而提高RNAi干扰效果。

参考文献 (23)

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