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细菌刺激下克氏原螯虾prx4基因的免疫响应和抗氧化功能研究

张明达 李倩倩 张文硕 秦仕宇 沈秀丽 杜志强

张明达,李倩倩,张文硕,等. 细菌刺激下克氏原螯虾prx4基因的免疫响应和抗氧化功能研究 [J]. 福建农业学报,2023,38(10):1185−1194 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.10.007
引用本文: 张明达,李倩倩,张文硕,等. 细菌刺激下克氏原螯虾prx4基因的免疫响应和抗氧化功能研究 [J]. 福建农业学报,2023,38(10):1185−1194 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.10.007
ZHANG M D, LI Q Q, ZHANG W S, et al. Immune Response and Antioxidant Activities of Bacteria-stimulated Prx4 in Procambarus clarkii [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2023,38(10):1185−1194 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.10.007
Citation: ZHANG M D, LI Q Q, ZHANG W S, et al. Immune Response and Antioxidant Activities of Bacteria-stimulated Prx4 in Procambarus clarkii [J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2023,38(10):1185−1194 doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.10.007

细菌刺激下克氏原螯虾prx4基因的免疫响应和抗氧化功能研究

doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.10.007
基金项目: 国家自然科学基金项目(32060834);内蒙古科技大学2022年基本科研业务费专项(028)
详细信息
    作者简介:

    张明达(1999 —),男,硕士研究生,主要从事无脊椎动物先天免疫方向相关研究,E-mail:1501643202@qq.com

    通讯作者:

    杜志强(1980 —),男,博士,教授,主要从事无脊椎动物先天免疫方向相关研究,E-mail:nmdzq1981@163.com

  • 中图分类号: S917.4

Immune Response and Antioxidant Activities of Bacteria-stimulated Prx4 in Procambarus clarkii

  • 摘要:   目的  克隆克氏原螯虾(Procambarus clarkii)过氧化物还原酶4基因(Pc-prx4),分析Pc-prx4基因的正常组织表达以及细菌刺激后的相对表达情况,分析其抗氧化功能,为Pc-prx4在病原刺激后的先天免疫机制以及抗氧化功能研究提供参考依据。  方法  以Pc-prx4为目的基因,通过相关网站和软件(Expasy、Translate tool、SMART、Expasy ProtParam tool、BLASTx、MEGA-X)进行生物信息学分析。通过qRT-PCR检测Pc-prx4在正常组织中的表达量以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、鲶爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)刺激下的表达量;通过构建表达菌株、诱导纯化rPc-PRX4蛋白,对重组蛋白进行抗氧化功能研究。  结果  Pc-prx4开放阅读框744 bp,编码247个氨基酸,含有烷基氢过氧化物还原酶(AhpC)结构域、巯基特异性抗氧化结构域和1-Cys prx过氧铁氧酶的C末端结构域;Pc-PRX4蛋白分子式为 C1249H1934N330O357S10,分子量为27.61 kDa,理论等电点(pI)为5.88,N端存在信号肽区域,C端存在1-Cys过氧化物还原蛋白结构域。Pc-prx4基因在各组织中均有所表达,其中血淋巴的表达量最高;在金黄色葡萄球菌和鲶爱德华氏菌刺激下,Pc-prx4基因在血细胞、肝胰腺、鳃、肠组织中表达均呈现整体升高的趋势。在保护质粒DNA抗氧化缺刻试验中,rPc-PRX4表现出抗氧化性,并随着重组蛋白浓度的升高,抗氧化效果越明显。  结论  Pc-prx4基因属于1-Cys prx,在血细胞中高表达,参与调节金黄色葡萄球菌、鲶爱德华氏菌刺激下的机体免疫应答过程,rPc-PRX4蛋白还具有与浓度大小相关的抗氧化功能,该基因参与免疫过程的调节和保护机体进行抗氧化的功能。
  • 图  1  Pc-prx4目的基因扩增

    M:标准DNA Marker;1~5:目的基因PCR扩增条带;6为阴性对照。

    Figure  1.  Results of Pc-prx4 amplification

    M: Standard DNA marker; 1-5: PCR amplified bands of target genes; 6: negative control.

    图  2  Pc-prx4序列功能结构域分析

    红色区域为信号肽区域,Pfam Redoxin为氧化还原蛋白结构域,Pfam AhpC-TSA为烷基过氧化氢还原酶结构域,Pfam 1-cys Prx-C为1-Cys过氧化物还原蛋白的C端结构域。

    Figure  2.  Functional domains and physicochemical properties of Pc-prx4

    Red: signal peptide region; Pfam Redoxin: REDOX protein domain; Pfam AhpC-TSA: alkyl peroxide reductase domain; and Pfam 1-cys Prx-C: C-terminal domain of 1-Cys peroxidase reductase.

    图  3  Pc-Prx4的cDNA序列及对应氨基酸残基

    黄色背景区域为信号肽区域,紫色字体为功能结构区域,绿色背景为起始密码子atg和终止密码子tag,红色背景区域为半胱氨酸(Cys),右侧数字分别对应核苷酸与氨基酸数目。

    Figure  3.  cDNA sequences and corresponding amino acid residues of Pc-Prx4

    Yellow background: signal peptide region; purple text: functional structure region; green background: start codon atg and tag stop codon; red background: cysteine (Cys); and numbers: counts of nucleotides and amino acids, respectively.

    图  4  Pc-Prx4氨基酸序列与其他物种氨基酸序列比对结果

    Figure  4.  Amino acid sequences of Pc-Prx4 and other species

    图  5  Pc-Prx4与其他物种共建系统进化树

    Figure  5.  Co-constructed phylogenetic tree of Pc-Prx4 with other species

    图  6  Pc-prx4正常组织分布的相对表达量

    不同字母表示不同组织间差异显著(P<0.05)

    Figure  6.  Relative expressions of Pc-prx4 in tissues of normal crayfish

    Data with different letters indicate significant differences among tissues at P<0.05.

    图  7  Pc-prx4金黄色葡萄球菌刺激下组织的相对表达量

    A为血细胞,B为肝胰腺,C为鳃组织,D为肠组织。不同字母表示不同时间点间差异显著(P<0.05)。图8同。

    Figure  7.  Relative expressions of Pc-prx4 in tissues of crayfish stimulated by S. aureus

    A: hemocytes;B: hepatopancreas;C: gills;D: intestines. Data with different letters indicate significant differences among different treatment time at P<0.05. Same for Table 8.

    图  8  Pc-prx4鲶爱德华氏菌刺激下组织的相对表达量

    Figure  8.  Relative expressions of Pc-prx4 in tissues of crayfish stimulated by E. ictaluri

    图  9  rPc-PRX4重组蛋白电泳

    M:标准蛋白Marker;1~4分别为诱导前、诱导后、破碎后上清、破碎后沉淀;5~8为纯化后的rPc-PRX4蛋白。

    Figure  9.  Electrophoretic diagram of rPc-PRX4

    M: Standard protein marker; 1–4: before induction, after induction, after crushing supernatant, and after crushing precipitation, respectively; 5–8: purified rPc-PRX4 protein.

    图  10  rPc-PRX4重组蛋白在金属催化氧化中对质粒DNA断裂的保护作用

    Figure  10.  Protection of rPc-PRX4 against plasmid DNA breakage in metal-catalyzed oxidation

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出版历程
  • 收稿日期:  2023-07-17
  • 修回日期:  2023-10-07
  • 网络出版日期:  2023-11-20
  • 刊出日期:  2023-10-28

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