Identification and Sequencing of Gene Related to Length of Rice Grain
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摘要:目的
水稻粒长是水稻粒型构成因素之一，直接影响籽粒产量，挖掘更多粒型相关基因对水稻粒型遗传改良具有重要意义。
方法以构建的水稻籼粳亚种间组合佳辐占×日本晴构建的499个重组自交系群体为研究材料，以水稻粒长性状为鉴定指标，通过图位克隆的方法，对水稻长粒性状数量性状基因座进行鉴定，并对该长粒性状在育种中的应用进行分析。
结果在重组自交系群体中检测到一个主效粒长基因GS3，并将该基因定位在物理距离16310～18161 kb，长度约为
1851 kb。通过测序分析发现，佳辐占与日本晴相比，该基因仅有1个碱基的差异，为第2个外显子的第48个碱基由C突变为A，造成蛋白翻译提前终止。进一步分析发现研究者利用粒长基因GS3选育的佳早1号和佳福香占在粒长、粒宽及长宽比上与野生型佳辐占无显著差异。结论佳辐占×日本晴重组自交系中可检测到长粒基因GS3，并可稳定遗传应用。本研究为后期GS3基因的功能研究以及水稻高产优质的遗传改良提供优异的基因资源和理论依据。
Abstract:ObjectiveThe gene that regulates the length of a rice grain, which directly relates to crop yield, was identified and sequenced for breed improvement.
MethodThrough map-based cloning, 499 recombinant inbred lines derived from the interspecific cross between Jiafuzhan (indica) and Nipponokin (japonica) were employed to identify the quantitative trait loci associated with the phenotypic trait.
ResultA major plasmid length of GS3 was 1851 kb, detected in the recombinant inbred line population located approximately within the physical distance 16310–18161 kb. Since only the 48th base of the second exon was mutated from C to A between the genes of Jiafuzhan and Nipponbare, protein translation was no longer necessary. Further analysis on Jiazao No. 1 and Jiafuxiangzhan bred using the GS3 showed no significant difference than the wild type Jiafuzhan in grain length, width, or length-width ratio.
ConclusionThe long-grain gene GS3 could be detected in the recombinant inbred lines of Jiafuzhan × Nipponbare, and could be stably inherited and applied. The information on GS3 obtained in this study was of value for future studies to genetically improve rice production.
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Keywords:
- rice /
- grain length /
- GS3 /
- gene mapping
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0. 引言
【研究意义】水稻（Oryza sativa L.）是人类不可或缺的粮食基石，是全球半数以上人口日常主食的首选。科学家预测，至2030年全球人口将突破80亿，届时水稻需求预计将增超40%[1]。水稻粒型是决定水稻产量和稻米品质的关键因素，受到一系列关键粒型基因的综合调控，是水稻品种选育的重要因素；细长型大米在中国南方及越南、老挝、印度等南亚国家备受青睐[2]。【前人研究进展】水稻粒长作为粒型的关键因素，对粒重影响显著 [3,4]。研究显示，粒型较长的水稻品种往往米质更佳[5]，外观品质也更受青睐[6]。目前，已鉴定出超过120个与粒长相关的数量性状基因座（Quantitative trait locus, QTL；http://www.gramene.org/）。尽管近年来研究者利用多种方法和材料鉴定了大量粒型性状相关QTL，但遗传背景和环境因素差异导致这些QTL的重复性[7−8]。至今，已成功克隆了如GL2、GS3、GL3.1/qGL3、LGY3、GL7/GW7、GS9/GL9、GL10等与粒长性状紧密相关的基因[9]。水稻第3号染色体上的qTGW3属GSK3/SHAGGY家族，有5个等位基因，其中OsSK41能与OsARF4（生长素抑制因子）互作并磷酸化，抑制其下游基因表达，通过编辑OsSK41或QTL聚合技术，可显著增大水稻籽粒并增加其粒重，为水稻等谷类作物的遗传改良提供新资源[10]。TGW3编码激酶，类似GSK3，负调控粒长，协同调节颖壳细胞大小与数量[11]。另一研究发现，GL3.3与GS3遗传互作，共促水稻粒型增大[12]。GS3位点含GS3和TT2两等位基因。GS3的cDNA全长956 bp，编码232个氨基酸的跨膜蛋白，含OSR结构域、跨膜区、TNFRNGFR家族半胱氨酸同源区和C端VWFC模块。GS3是控制籽粒大小的关键QTL，具负调控作用。其表达随穗发育减少，在根冠中显著，在胚、茎端分生组织等中较弱。OSR结构域对调控籽粒长度至关重要。大粒品种中，GS3第2外显子突变致蛋白提前终止，OSR结构域残缺，籽粒显著增长。而C端TNFRNGFR和VWFC结构域抑制OSR功能，失活突变导致籽粒极短[13]。TT2作为与GS3位点相同的一个基因，编码一个G蛋白γ亚基，对水稻在营养生长期和生殖生长期内的耐热性具有关键作用，且不会带来产量损失。近期研究发现，转录因子SCT1（sensing Ca2+ transcription factor 1）通过Ca2+增强的方式与钙调素相互作用，解码Ca2+信号，并作为某些靶基因（如wax synthesis regulatory 2, OsWR2）的负调控因子。当TT2基因被破坏时，受热触发的Ca2+信号减少，导致钙调素与SCT1之间的相互作用减弱[14]。【本研究切入点】目前，虽然已经鉴定了大量粒型相关的基因，但在生产上具有较高应用价值的基因较少。因此，挖掘更多粒型相关基因，筛选具有重要应用前景的基因显得尤为重要。【拟解决的关键问题】本研究利用水稻籼粳亚种间组合佳辐占×日本晴构建的499个重组自交系群体为材料，以水稻粒长性状为目标性状，对水稻主效粒长基因GS3数量性状基因位点进行鉴定，并对该基因进行克隆和序列分析，为GS3基因的分子调控网络研究以及育种利用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 供试材料
长粒籼稻材料佳辐占和短粒粳稻材料日本晴由福建省农业科学院水稻研究所种质创制研究室保存。前期研究组以佳辐占为母本、以日本晴为父本，通过单籽传法构建了499个重组自交系群体，这499个株系已稳定，目前已自交到F10代。
1.2 材料种植
2017年6月，在福建省三明市沙县夏茂镇福建省农业科学院水稻研究所水稻育种基地（北纬26°34′，东经117°40′），分别种植了佳辐占、日本晴和499个重组自交系材料。每个材料重复3次，每个重复种4行，每行8株，所有材料均单株种植，按照常规的栽培技术进行管理。
1.3 亲本与重组自交系性状调查分析
分析佳辐占、日本晴及499个重组自交系材料的粒长，具体方法参照Tan等[15]的方法。成熟后，对重组自交系群体中极端长粒单株和极端短粒单株分别进行取样，选择极端长粒50株和极端短粒50株作为连锁群体。
1.4 材料鉴定
水稻叶片基因组DNA提取、PCR分析及电泳检测方法均参照杨德卫等[16]的方法。以CTAB方法提取水稻基因组DNA，PCR反应在Eppendorf AG
22331 型PCR仪上进行，反应程序为：98 ℃、30 s，98 ℃，10 s，60 ℃、15 s，72 ℃、20 s，72 ℃、3 min，循环数为35。反应产物首先在2.5%琼脂糖凝胶上电泳，经溴化乙锭（EB）染色后于紫外灯下观察，并在Gene genius凝胶成像仪上成像。1.5 长粒基因GS3定位
以50株极端长粒和50株极端短粒作为初步定位的群体，通过BSA测序方法，对目标基因进行定位与连锁分析。具体的方法是利用差异目标性状的两个亲本构建家系，在子代分离群体中选取目标性状个体构建DNA混合池，采用高通量测序技术对混池DNA进行建库测序，开发全基因组范围内的不同类型分子标记，通过计算标记的基因型频率，在基因组范围内检测并获得与目标性状相关联的位点与基因。
1.6 长粒基因GS3克隆
以已克隆的长粒基因GS3序列为模板[13]，设计目标基因引物（GS3-F：GCCATTCAAAGCAAAGCAC；GS3-R：CCAAATTACAGATAACCGCAAG），利用设计的引物对目标基因进行扩增并测序。
2. 结果与分析
2.1 亲本佳辐占和日本晴粒长性状比较
调查两份水稻材料佳辐占和日本晴粒型相关性状，发现其粒长分别为（11.12 ± 0.21）、（7.42 ± 0.28）mm，粒宽分别为（2.82 ± 0.07）、（3.24 ± 0.08 ）mm，千粒重分别为（29.12 ± 0.41）、（22.12 ± 0.29）g，两者在粒长、粒宽和千粒重均存在显著差异（图1），为后续粒长基因鉴定提供基础。
2.2 重组自交系粒长性状分析
为进一步分析佳辐占×日本晴形成的499个重组自交系粒长的遗传特征，对这499个重组自交系粒长进行调查和统计，结果显示499个重组自交系的粒长性状呈连续分布状态，粒长性状表现出数量性状遗传特征（图2）。
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图 2 佳辐占×日本晴重组自交系粒长分布Figure 2. Frequency distribution of grain length in Jiafuzhan×Nipponbare2.3 长粒基因初步定位
499个重组自交系中的长粒性状符合正态分布，说明该长粒性状为主效基因控制。为了进一步定位该粒长基因，从499个重组自交系中，选择50个极端长粒株系和50个极端短粒株系，作为定位的遗传群体，并利用BSA测序方法进行定位。结果显示，该长粒基因被定位在水稻第3染色体上，进一步分析显示，位于
16310 ～18161 kb，物理距离约为1851 kb（图3）。2.4 长粒基因GS3的序列分析
进一步分析发现，在1851 kb区间内，有一个已经克隆的粒长基因GS3（Os03g0407400），推测本研究鉴定的粒长基因与GS3[13]很可能是等位基因。
为了进一步克隆该长粒基因，根据GS3基因序列设计引物（F：GCCATTCAAAGCAAAGCAC；R：CCAAATTACAGATAACCGCAAG），对佳辐占和日本晴分别进行测序，结果显示，佳辐占与日本晴相比，仅有1个碱基的差异，其余序列均相同。分析显示，突变位于第2外显子第48个碱基，由C突变为A，导致TGC变为终止密码子TGA，蛋白翻译提前终止（图4）。Fan 等[13]研究表明，与短粒品种相比，长粒品种GS3 第2 外显子中第48个碱基，由C突变为A，从而导致TGC突变成终止密码子TGA，造成蛋白翻译提前终止，也就是说长粒品种明恢63的长粒基因GS3 与佳辐占的长粒基因为同一个基因。据此，我们将佳辐占中的长粒基因命名为GS3。
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图 4 GS3基因的结构比较分析GS3有5个外显子，在第2外显子出现1 bp的突变。Figure 4. Structure of GS3GS3 has five exons, and exhibits a 1 bp substitute in the second exon.2.5 长粒基因GS3的应用分析
为了进一步分析GS3基因育种利用情况，我们发现育种者利用GS3目前已经选育出的佳早1号（闽审稻2007002）和佳福香占（闽审稻20200044）两个品种通过福建省审定（https://www.ricedata.cn/variety/）。比较佳早1号、佳福香占与佳辐占粒型相关性状，结果显示这两个品种在粒长、粒宽及长宽比上与佳辐占无显著差异（表1）。
表 1 佳辐占、佳早1号和佳福香占等粒型相关性状比较Table 1. Grain phenotypes of Jiafuzhan, Jiazao No. 1, and Jiafuxiangzhan名称
Name粒长
Grain length/
mm粒宽
Grain width/
mm长宽比
Length-width
ratio佳辐占 Jiafuzhan 11.13±0.24 2.70± 0.05 4.12±0.18 佳早1号 Jiazao 1 11.05±0.21 2.72± 0.06 4.06±0.17 佳福香占 Jiafuxiangzhan 11.11±0.23 2.70± 0.06 4.11±0.18 3. 讨论
近年来，研究者利用不同的研究方法，已从不同材料中鉴定了120个与水稻粒长相关的QTL （http://www.gramene.org）。尽管已克隆多个相关基因，但部分基因与不利性状连锁，限制其生产应用[15]。例如，粒长基因PGL1受APG负调控因子影响，该基因的功能被PGL1抑制，从而进一步限制了PGL1 的应用范围[17] 。因此鉴定与分离更多与水稻粒长相关基因以及对应的等位基因，对水稻粒型的遗传改良具有极其重要的意义。
水稻粒长基因的遗传极为复杂，主要是由于不同材料的遗传背景不同、各种微效基因的叠加以及加性效应等影响，使其遗传特性表现得极为复杂[14, 18] 。有研究显示水稻粒长性状遗传主要受加性效应的影响[19]，有研究发现通常情况杂种的粒长是介于双亲之间[20]，也有研究发现粒长性状表现明显的超亲分离现象[21]。因此，为了进一步研究粒长基因的遗传特征，构建遗传背景单一或遗传背景清晰的重组自交系或者近等基因系是必须的。
本研究利用图位克隆方法，将佳辐占长粒的主效粒长基因GS3进行了初步鉴定，该基因被初步定位在水稻第3染色体上，位于物理距离
16310～ 18161 kb，该区间有一个已经克隆的长粒基因GS3。为了进一步分析GS3与GS3之间的关系，我们对佳辐占中的GS3基因进行测序，测序结果分析发现佳辐占中长粒基因GS3与明恢63中的长粒基因GS3序列相同，其突变位点均是该基因第2外显子中第48个碱基，由C突变为A，从而导致TGC突变成终止密码子TGA，造成蛋白翻译提前终止。前人研究发现GS3作为一个负调节子发挥作用[13]。为了进一步拓宽GS3及GS3的利用价值，育种学家可以通过基因编辑技术或者定点突变的技术，对该基因进行定点敲除或者突变，使得该基因失去功能，从而表现长粒性状。同时育种者可以通过分子标记辅助育种技术来改良水稻粒长性状。例如，以佳辐占长粒性状作为供体，通过杂交方法，培养出了系列水稻新品种，其中佳早1号、佳福香占是以佳辐占为供体亲本培育的常规稻品种，表现长粒的表型，且佳福香占还具有香味特征。育种实践显示GS3显示具有较强的遗传特性和很好的育种价值。因此，本研究鉴定的GS3无论在今后粒型遗传规律探索以及调控机理研究方面，还是在水稻长粒新品种选育方法均具有重要的理论和实践意义。 -
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图 2 佳辐占×日本晴重组自交系粒长分布
Figure 2. Frequency distribution of grain length in Jiafuzhan×Nipponbare
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图 4 GS3基因的结构比较分析
GS3有5个外显子，在第2外显子出现1 bp的突变。
Figure 4. Structure of GS3
GS3 has five exons, and exhibits a 1 bp substitute in the second exon.
表 1 佳辐占、佳早1号和佳福香占等粒型相关性状比较
Table 1 Grain phenotypes of Jiafuzhan, Jiazao No. 1, and Jiafuxiangzhan
名称
Name粒长
Grain length/
mm粒宽
Grain width/
mm长宽比
Length-width
ratio佳辐占 Jiafuzhan 11.13±0.24 2.70± 0.05 4.12±0.18 佳早1号 Jiazao 1 11.05±0.21 2.72± 0.06 4.06±0.17 佳福香占 Jiafuxiangzhan 11.11±0.23 2.70± 0.06 4.11±0.18 
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