0.   引言

【研究意义】鳗鲡（Anguilla）是一种具有重要经济价值的洄游性鱼类，其营养丰富、肉质鲜美^[1,2]。全球鳗鲡养殖产量的70%来自中国^[3]。但是随着养殖集约化程度的不断提高，国内鳗鲡养殖病害情况也日趋严重^[4]，其中鳗鲡圆环病毒（Eel circovirus, EeCV）给养鳗业带来了巨大的经济损失^{[5, 6]}。EeCV为12～26 nm单链环状DNA病毒，其病毒粒子衣壳仅由1种结构蛋白（衣壳蛋白）组成^[4]。自2017年以来，GenBank中可查询到已完成全基因组序列的鳗鲡圆环病毒仅有4株，分别为NC_023421.1（Ba 1株）、KU951580.1（AN 24株）、KU951579.1（AN 10株）和KU951578.1（AN 8株）。鳗鲡圆环病毒毒株难以分离，导致形态学结构及疫苗研发等工作无法深入展开。利用基因工程技术构建的病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）无需分离毒株即可揭示病毒的特征，能够解决目前的难题^[7]。EeCV Cap蛋白是EeCV的主要结构蛋白，参与病毒附着过程，且能引发宿主免疫反应。因此基于EeCV VLPs的研究具有理论指导意义和潜在应用价值。【前人研究进展】病毒样颗粒与真实病毒的构象极其相似，但是其内部不含核酸，所以不能进行复制也没有感染能力，因而不存在病毒基因组交换重组、病毒未完全灭活、病毒返祖等潜在风险，而且病毒结构蛋白可以在各种活体或无细胞的表达系统中进行组装和重建成类病毒结构^{[8, 9]}。常见的VLPs有猪圆环病毒2型VLPs^[10]、猪细小病毒VLPs^[11]、Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒VLPs^[12]、神经坏死病毒VLPs^[13]，表明利用基因工程手段制备VLPs的技术已经十分成熟。【本研究切入点】目前EeCV的研究主要集中在病毒检测方法和毒株分离方面，关于EeCV VLPs的研究尚未见相关报道。【拟解决的关键问题】本研究克隆表达了EeCV Cap蛋白基因，并通过透射电镜观察其体外自组装成VLPs，首次披露EeCV形状与大小，也为研制EeCV亚单位疫苗和开发EeCV抗体检测试剂盒等奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

DL 12000 Maker、限制性核酸内切酶Bam H I--Xho I购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；大肠埃希菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）感受态细胞、pET-32a（+）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG）、非预染蛋白Marker、预染蛋白Marker、小鼠抗6×His Tag单克隆抗体（D191001）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HBR）标记山羊抗小鼠IgG（D110087）、柱式DNA胶回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Ni-NTA镍柱预装柱购自美国通用电气公司；二氨基联苯胺显色试剂盒（DA1010）购自北京索莱宝科技有限公司；鳗鲡圆环病毒DNA由临床病料组织中提取，本实验室自行保存于−20 ℃。

1.2   目的基因的获得与原核表达质粒的构建

根据EeCV Cap蛋白基因组序列（GenBank登录号：NC 023421.1）设计特异性引物EeCV-Cap-F1：5′-ATGCCATTCTACCGGAGGCG-3′和EeCV-Cap-R1：5′-CTATGCGCTGCGTAGATTCCA-3′。以临床组织病料中提取的DNA为模板，进行PCR扩增回收目的片段。目的片段送往上海生工生物有限公司进行测序，NCBI比对正确后进行密码子优化。分别在优化后的序列5′和3′端加入Bam H I和Xho I两种酶切位点，由上海生工生物工程有限公司合成EeCV Cap全序列。分别用限制性内切酶Bam H I和Xho I将人工合成的EeCV Cap蛋白全长序列与载体pET-32a（+）进行酶切，回收酶切产物后使用T4 DNA连接酶连接，并转化入大肠埃希菌DH5α。筛选阳性克隆扩大培养，双酶切鉴定重组质粒pET32a-EeCV-Cap。

1.3   目的蛋白的诱导表达

将重组质粒pET32a-EeCV-Cap转化至大肠埃希菌BL21（DE3）感受态细胞中，挑取阳性克隆后，在LB培养基（50 µg·mL⁻¹氨苄青霉素和34 µg·mL⁻¹氯霉素）中于37 ℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入终浓度为0.5 mmol·L⁻¹的IPTG，分别于20 ℃培养16 h，37 ℃培养6 h，阴性对照组未添加IPTG。4 ℃、4000 r·min⁻¹离心10 min收集重组菌。每100 mg湿菌体加入3 mL菌体裂解液（8 mol·L⁻¹尿素，50 mmol·L⁻¹ Tris-HCl，300 mmol·L⁻¹ NaCl，0.1% Triton X-100，pH 8.0）进行重悬，于冰水浴中超声破碎。收集上清与沉淀，用于后续SDS-PAGE分析蛋白的表达情况。

1.4   目的蛋白的纯化

目的蛋白纯化参考赵强等^[14]的方法稍作改动。平衡Ni-NTA亲和层析柱后，将超声裂解收集的上清液通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化，流速为0.3 mL·min⁻¹；再以洗涤液（含50 mmol·L⁻¹咪唑）洗脱杂蛋白；最后以洗脱液（含500 mmol·L⁻¹咪唑）对目的蛋白进行洗脱，透析脱盐后保存在蛋白缓冲液中。使用PEG 20000浓缩蛋白液，0.45 μm滤膜过滤分装保存于−80 ℃。

1.5   目的蛋白鉴定

处理后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后的蛋白胶于23 V、30 min转印至NC膜，并于5%牛血清蛋白4 ℃过夜封闭；封闭结束后以1∶5000的比例在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline-Tween-20, PBST）中加入小鼠抗6 × His Tag单克隆抗体，室温摇床孵育1 h后用PBST洗膜5次。将HBR标记山羊抗小鼠IgG和PBST按1∶5000稀释，室温摇床孵育1 h；二抗孵育完毕用PBST洗膜5次，避光显色2 min后观察结果。

1.6   蛋白质结构的检测及组装特性分析

蛋白质样品的透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）观察方法如下：用戊二醛和1%锇酸固定样品，酒精脱水后使用丙酮和环氧树脂渗透，最后再用环氧树脂包埋。固化之后将样品修成合适的大小和形状，置于切片机上切片，厚度60～100 nm，铅和铀双染色后置于TEM（型号：Tecnai G2 20 TWIN）下观察分析EeCV Cap蛋白的组装特性。

2.   结果与分析

2.1   原核表达质粒的鉴定

以临床病鳗中提取的DNA为模板，PCR扩增EeCV Cap蛋白基因，测序后进行密码子优化（图1），并交由生工生物（上海）有限公司进行全序列合成，不含终止密码子。

图  1  密码子优化位点

红色部分为优化位点。

Figure  1.  Map of codon optimization sites

Red portion indicates optimization site.

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使用限制性内切酶Bam H I和Xho I对pET-32a-EeCV-Cap重组质粒进行双酶切鉴定，获得357 bp的EeCV Cap蛋白基因和5900 bp的载体片段（图2），条带大小符合预期。质粒测序结果与密码子优化后的序列完全相符，说明成功构建重组表达质粒pET-32a-EeCV-Cap。

图  2  pET-32a-EeCV-Cap重组质粒的双酶切鉴定

M：DNA marker；1：pET-32a-EeCV-Cap重组质粒；2：pET-32a-EeCV-Cap重组质粒Bam H I/Xho I酶切。

Figure  2.  Double enzyme digestion on pET-32a-EeCV-recombinant plasmid

M: DNA marker; 1: pET-32a-EeCV-Cap recombinant plasmid; 2: pET-32a-EeCV-Cap recombinant plasmid Bam H I/Xho I digestion.

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2.2   重组菌的诱导表达及可溶性分析

诱导后的重组菌pET-32a-EeCV-Cap在31 kDa左右有一条明显的条带，与预期大小相符。收集20 ℃诱导培养16 h和37 ℃诱导培养6 h后的菌体沉淀，重悬沉淀后超声裂解，分别对上清和沉淀进行分析。结果表明EeCV Cap蛋白可在原核表达系统中表达，且在20 ℃使用0.5 mmol·L⁻¹ IPTG诱导16 h时，其表达量高于20 ℃诱导培养16 h的表达量（图3）。

图  3  重组蛋白SDS-PAGE表达鉴定

M：蛋白marker；1：未诱导菌液；2：20 ℃诱导表达上清；3：20 ℃诱导表达沉淀；4：37 ℃诱导表达上清；5：37 ℃诱导表达沉淀。

Figure  3.  Identification of recombinant protein by SDS-PAGE

M: protein marker; 1: bacterial solution not induced; 2: supernatant of solution with induced expression at 20 ℃; 3: precipitate of solution with induced expression at 20 ℃; 4: supernatant of solution with induced expression at 37 ℃; 5: precipitate of solution with induced expression at 37 ℃.

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2.3   EeCV Cap的纯化及Western blot分析

重组菌表达的可溶性蛋白经镍柱纯化后，得到高纯度、单一的目的蛋白（图4a）。将纯化后的蛋白进行Western blot鉴定。一抗为小鼠抗6×His Tag单克隆抗体，二抗为HBR标记山羊抗小鼠IgG，在31 kDa处有一条明显的特异性条带，符合预期大小（图4b）。

图  4  纯化后带His标签的EeCV Cap蛋白

a：SDS-PAGE电泳；b：Western blot 验证。M：蛋白marker；1：纯化后带His标签的EeCV Cap蛋白。

Figure  4.  Purified EeCV-Cap with a His tag

a: SDS-PAGE electrophoresis; b: Western blot; M: protein marker; 1: EeCV-Cap purified with a His tag.

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2.4   EeCV Cap的透射电镜观察

经过固定包埋染色后的蛋白样品，在TEM下可观察到20 nm左右的病毒样颗粒，与天然圆环病毒粒子相似。说明利用原核系统表达的EeCV Cap能够自发组装成形态结构良好的VLPs（图5）。

图  5  VLPs的透射电镜观察

红色箭头处为VLPs。

Figure  5.  TEM images of VLPs

VLPs are pointed at by red arrows.

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3.   讨论

VLPs是由病毒Cap蛋白自组装形成的类似病毒的空心颗粒^[15]。VLPs模仿了天然病毒粒子的整体结构^[16]，保留了与天然病毒相似的抗原构象，所以与天然病毒难以区分，能激发机体强烈的细胞免疫与体液免疫，适合作为同源病毒的疫苗^[17]；VLPs不含有病毒的基因组结构，不具有传染性和可复制性，具有安全性的优势^{[7, 18]}。目前，VLPs在水产上也逐渐进入研究阶段，例如Shivappa等^[19]构建的传染性胰脏坏死病毒VLPs，用其免疫后的大西洋鲑（Salmo salar）攻毒后死亡率下降至56%；Marsian等^[20]利用构建的神经坏死病毒VLPs免疫舌齿鲈（Dicentrarchus labrax），死亡率显著低于对照组。表明制备EeCV VLPs作为疫苗使用具有较好的应用前景。

真核和原核表达系统均是表达病毒Cap蛋白基因的常用系统，其中大肠埃希菌表达系统具有遗传背景清楚、操作简便、成本低等优点，被广为应用^[21]。亲和层析法纯化的优点是高效、快速、纯化效果好、杂蛋白少，缺点是成本高^[22]。为了获得较高纯度的EeCV Cap蛋白，本试验采用大肠埃希菌表达系统制备EeCV Cap蛋白，并使用亲和层析法进行纯化。关于EeCV Cap蛋白克隆表达的研究尚未见报道，而圆环病毒属中猪圆环病毒研究较为广泛。张英婕等^[23]通过原核表达系统制备出猪圆环病毒2型VLPs，25 ℃诱导表达10 h，并通过镍柱纯化获得约27 kDa的Cap蛋白，直径大小约为17～20 nm，与本试验制备的EeCV VLPs的大小相似。本研究通过比较20 ℃诱导培养16 h和37 ℃诱导培养6 h的表达量，发现EeCV Cap蛋白在20 ℃诱导条件下表达量更好。

本研究通过EeCV Cap蛋白基因组的密码子优化和人工合成，完成了重组质粒pET32a-EeCV-Cap的构建，并在原核表达系统中实现了EeCV Cap蛋白的可溶性表达。优化诱导条件后将目的蛋白成功纯化，经SDS-PAGE与Western blot鉴定，纯化后的EeCV Cap重组蛋白约为31 kDa，与预期结果相同。EeCV Cap蛋白经透射电镜观察，能在体外成功自发组装成直径20 nm左右的VLPs。本研究为研制出成本低廉、安全有效、效果稳定的EeCV亚单位疫苗及相关生物制品奠定了基础。