0.   引言

【研究意义】鸡病毒性传染性腺胃炎（Transmissible viral proventriculitis，TVP）为肉鸡和蛋鸡群常见的一种流行性疾病，临床表现为生长不良、粪便过料、极度消瘦等，剖检病变包括腺胃壁增厚、腺胃肿大如球、腺胃黏膜出血、溃疡等，主要病理变化为显微镜下观察到大量的炎性细胞浸润至腺管间及黏膜层^[1-2]，可显著降低肉鸡和蛋鸡生产性能，给养殖业造成巨大经济损失。研究表明，圆圈病毒3型（Gyrovirus 3，GyV3）是引起TVP的重要病原之一^[3]。GyV3为单链环状DNA病毒，属于细环病毒科 （Anelloviridae）圆圈病毒属（Gyrovirus）^[4]。GyV3诱导的持续感染以腹泻、再生障碍性贫血、免疫抑制和持续的全身淋巴细胞炎症为特征，主要感染14～35日龄的肉鸡和蛋鸡，在野生鸟类中也有流行^[5]。GyV3是近年来新发现的病毒，对于该病毒的防控手段尚未完善。因此，建立一种操作简便、快速灵敏的诊断方法对GyV3的诊断和流行病学调查具有重要意义。【前人研究进展】目前关于GyV3诊断技术的报道较少，主要有普通PCR^[6]、SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR^[7]以及ELISA检测方法^[8]，传统的方法或有灵敏性低、操作繁琐、成本高等局限性。探针法荧光定量PCR技术具有快速、实时定量的特性，同时兼具敏感性高、特异性强、操作简便的优点，在临床病原检测中具有显著优势^[9]。【本研究切入点】目前关于GyV3诊断方法的研究尚待深入探讨，且针对GyV3的TaqMan荧光定量PCR检测方法尚无报道。【拟解决的关键问题】本研究以GyV3 VP2基因保守区序列为依据，建立针对GyV3的荧光定量PCR检测方法，以期解决临床上关于该病原的鉴别诊断难题。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   病料来源

禽圆圈病毒3型（Gyrovirus 3，GyV3）、传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）、马立克氏病毒（Marek's disease virus，MDV）、鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anemia virus， CIAV）、禽白血病毒（Avian Ieukosis virus，ALV）等阳性全基因组核酸和疑似传染性腺胃炎组织病料均由龙岩学院预防兽医学与生物技术福建省高等学校重点实验室鉴定和保存。

1.1.2   主要试剂和仪器

DNA Marker、2× PCR mix、FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit V2试剂盒、HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）试剂盒、基因组提取试剂盒、2 × Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix、PCR产物纯化试剂盒等均购自诺唯赞生物科技股份有限公司；pMD-18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司；感受态细胞 E.coli DH5α购自上海唯地生物技术有限公司。

梯度PCR仪、微量分光光度计、台式高速冷冻离心机等购自Thermo公司；实时荧光定量PCR仪购自eppendorf公司，电泳仪购自上海天能生命科学有限公司，凝胶分析成像系统购自ProteinSimple公司。

1.2   试验方法

1.2.1   引物和探针的设计

根据NCBI数据库中GyV3 VP2基因保守区序列，利用Primer 5、Megalign等软件设计一对用于检测GyV3的特异性引物以及一条探针，另外设计一对SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测引物以及普通PCR GyV3 VP2引物，引物和探针均由上海生工生物工程有限公司合成，其序列见表1。

表  1  引物和探针序列

Table  1.  Sequences of primers and probe

引物名称 Primer name	序列（5′-3′） Sequences	片段大小 Product size/bp	备注 Note
GyV3-P	FAM-CGACCTGGATGGTTCTGTAGTTCTTGG-BHQ1	—	探针 Probe
GyV3-F	CCGACTCCGACGAACTTATTG	113	探针法引物 Primers of TaqMan PCR
GyV3-R	AAACACGACTCTCCCTACCT
GyV3-qPCR-F	TGGATTACATCGCGAACAG	174	染料法引物 Primers of SYBR Green ⅠPCR
GyV3-qPCR-R	GCATATCGAAGTTTACGCC
GyV3 VP2-F	ATGTCATCCGGCGGTCTAG	720	普通PCR引物 Primers of conventional PCR
GyV3 VP2-R	TTACCAGGTAAGATCCCGGATG

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1.2.2   标准品的制备

以GyV3阳性核酸为模板，GyV3 VP2-F/R为上下游引物（其序列见表1），进行PCR扩增，扩增程序：2× PCR mix 25 μL，引物（GyV3 VP2-F/R）各1 μL，模板2 μL，ddH₂O 21 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，35个循环。将验证有单一目的条带的PCR产物进行产物回收，回收产物连接pMD-18-T载体，转化至DH5α感受态细胞并涂布于LB/Amp平板，37 ℃，16 h。筛选阳性克隆，提取重组质粒作为质粒标准品。测定浓度，计算拷贝数，置于−20 ℃保存备用。

1.2.3   荧光定量PCR反应条件优化

以构建的标准品为模板，按照诺唯赞Animal Detection U+ Probe qPCR Super Pre Mix试剂盒说明书配置25 μL实时荧光定量PCR反应体系，对探针GyV3-P浓度（50～250 nmol·L⁻¹）、引物GyV3-F/R浓度（0.1～1.0 μmol·L⁻¹）以及退火温度（55～61 ℃）等扩增条件进行优化，反应完成后根据C_t值和反应扩增曲线筛选出最佳反应条件。

1.2.4   荧光定量PCR反应标准曲线的建立

以构建的标准品进行10倍倍比稀释，取6个不同含量（1.585×10³～1.585×10⁸ copies·μL⁻¹）的阳性质粒作为模板，每个梯度3个重复，采用优化后的反应条件进行扩增，绘制标准曲线。

1.2.5   荧光定量PCR特异性试验

采用优化后的反应条件，以GyV3以及IBDV、MDV、ALV、CIAV等禽类常见的引起传染性腺胃炎的病原为模板进行扩增，对所建立的方法进行特异性检测。

1.2.6   荧光定量PCR敏感性试验

以各稀释梯度（1.585×10⁰～1.585×10⁸ copies·μL⁻¹）的标准品为模板，采用优化后的荧光定量反应条件进行扩增，每个梯度3个重复。同时对每个梯度标准品进行SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR扩增，比较不同方法的敏感性。

1.2.7   荧光定量PCR重复性试验

选取3个不同浓度的标准品质粒 (1.585×10⁶、1.585×10³、1.585×10¹ copies·μL⁻¹)，用建立的荧光定量PCR方法进行检测，在同一时间设立3个重复进行批内重复性试验；在3个不同时间点对以上3个浓度的标准品质粒进行批间重复性试验。记录每次试验的C_t值，计算标准差和变异系数，评价建立的荧光定量PCR检测方法的重复性。

1.2.8   荧光定量PCR临床样品检测及模拟样品的制备

取实验室前期收集的50份疑似传染性腺胃炎的病料，按照诺唯赞FastPure Viral DNA/RNA Mini Kit V2试剂盒说明书提核酸，并按照HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper) 试剂盒说明书去除基因组DNA并逆转录为cDNA，分别进行TaqMan荧光定量和SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测，对两种检测方法的符合率进行比较。

取经PCR检测GyV3病毒为阴性的鸡肝脏组织，分为4份，各20 mg，加入不同浓度重组质粒（1.585×10³～1.585×10⁶ copies·μL⁻¹）100 μL，按照诺唯赞FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit试剂盒说明书提取核酸，制备成模拟样品，置于−20 ℃保存备用，用于针对已知样品进行参比试验。

2.   结果与分析

2.1   标准品的制备

以GyV3阳性核酸为模板，GyV3 VP2-F/R为上下游引物进行PCR扩增，并将PCR回收产物克隆到pMD-18-T载体上，成功构建重组质粒，提取的质粒DNA质量浓度为447.7 ng·μL⁻¹，得出质粒的拷贝数为1.585×10⁹ copies·μL⁻¹。

2.2   荧光定量PCR反应条件的优化

经优化确定最佳反应体系为：2 × Animal Detection U+ Probe qPCR Super PreMix 12.5 μL，终浓度1.0 μmol·L⁻¹的引物GyV3-F/R 各0.5 μL，终浓度为250 nmol·L⁻¹的探针GyV3-P 0.5 μL，DNA模板5 μL，ddH₂O 6 μL。反应程序：37 ℃，2 min；95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；55 ℃，10 s；72 ℃，30 s，共45个循环。

2.3   荧光定量PCR反应标准曲线的建立

以6个不同含量（1.585×10³～1.585×10⁸ copies·μL⁻¹）的阳性质粒作为模板，利用建立的荧光定量检测方法进行扩增，得到扩增曲线。以模板拷贝数的对数为横坐标，3个重复的C_t值平均数为纵坐标，绘制标准曲线 （图1），推导出标准线性回归方程为y=−3.22x+34.65，相关系数R²=0.999。

图  1  GyV3荧光定量标准曲线

Figure  1.  qPCR standard curve for GyV3

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2.4   荧光定量PCR特异性试验

利用优化后的荧光定量PCR方法，以GyV3、IBDV、MDV、ALV、CIAV为模板进行扩增，结果见图2，只有GyV3有明显的扩增曲线，其他4种禽类病毒并无明显的荧光信号，表明该方法特异性好，与上述病毒均无交叉反应。

图  2  GyV3探针法荧光定量特异性

1～5分别为GyV3、IBDV、MDV、ALV、CIAV。

Figure  2.  Specificity of TaqMan RT-qPCR assay

1–5 represent GyV3, IBDV, MDV, ALV, and CIAV, respectively.

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2.5   荧光定量PCR敏感性试验

以各稀释梯度 1.585×10⁰～1.585×10⁸ copies·μL⁻¹ 的标准品为模板，采用优化后的荧光定量反应条件进行扩增，扩增曲线见图3。结果表明，本研究建立的荧光定量检测方法最低检测限度在1.585×10⁰ copies·μL⁻¹。SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测结果见图4，最低检测限度为1.585×10¹ copies·μL⁻¹，对比可得本研究建立的荧光定量PCR检测方法比SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR敏感性提高了10倍。

图  3  GyV3探针法荧光定量方法的敏感性

1～9分别为质粒含量1.585×10⁸～1.585×10⁰ copies·μL⁻¹。

Figure  3.  Sensitivity of TaqMan RT-qPCR assay for GyV3

1–9 represent plasmid concentrations at 1.585×10⁸–1.585×10⁰ copies·μL⁻¹, respectively.

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图  4  GyV3 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的敏感性

1～8分别为质粒含量1.585×10⁸～1.585×10¹ copies·μL⁻¹。

Figure  4.  Sensitivity SYBR Green I PCR assay for GyV3

1–8 represent plasmid concentrations at 1.585×10⁸–1.585×10¹ copies·μL⁻¹, respectively.

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2.6   荧光定量PCR重复性试验

对同一批次的3个不同浓度的标准品质粒（1.585×10⁶、1.585×10³、1.585×10¹ copies·μL⁻¹）进行批内和批间重复性试验，结果显示，批内和批间变异系数均小于1%，表明本研究建立的荧光定量PCR具有良好的重复性 （表2）。

表  2  荧光定量PCR重复性试验

Table  2.  Repeatability and stability of qPCR on GyV3 detection

标准质粒浓度 Concentration of standard-plasmid/ (copies·μL−1)	批内变异试验 Intra-assay variability			批间变异试验 Inter-assay variability
	平均数±标准差 $\overline{x}$±SD	变异系数 CV/%		平均数±标准差 $\overline{x}$±SD	变异系数 CV/%
1.585×106	15.52±0.04	0.32		15.57±0.11	0.73
1.585×103	24.78±0.05	0.22		24.61±0.06	0.26
1.585×101	32.17±0.13	0.42		32.38±0.14	0.44

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2.7   荧光定量PCR临床样品及模拟样品检测

对本实验室保存的50份疑似传染性腺胃炎病料进行探针法荧光定量和SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测，本试验构建的探针法荧光定量PCR检测出7份阳性，与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR符合率达到100%。

4份不同浓度的模拟样品均扩增出与预期相符的扩增曲线，结果见图5，与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测结果符合率达100%。由此可见，本研究建立的检测方法具有较高的敏感性以及良好的稳定性，可用于临床样品的检测。

图  5  GyV3探针法荧光定量PCR模拟样本检测

1～4分别为质粒含量1.585×10³～1.585×10⁶ copies·μL⁻¹。

Figure  5.  GyV3 TaqMan RT-qPCR detection on simulated sample

1–4 represent plasmid concentrations at 1.585×10³–1.585×10⁶ copies·μL⁻¹, respectively.

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3.   讨论

传染性腺胃炎是一种以腺胃乳头出血、腺胃肿胀为临床特征的疾病^[10]，引起该病的病原较为复杂，主要有圆圈病毒3型、传染性贫血病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡腺胃坏死病毒（Chicken proventricular necrosis virus，CPNV）等^[3,11-13]。该病在我国广东、福建、山东等多个省份均有报道^[11,14-15]，虽然总体发生率不高但发病后传播速度快，治愈率差，导致禽类饲料转化率低、体重下降，严重影响商业肉鸡的经济价值^[16]。

圆圈病毒能抵抗高达120 ℃的干热灭活程序，可在胃酸环境下存活，因此可以在环境中持续存在和传播^[17-18]。致病性试验表明，GyV3可引起鸡再生障碍性贫血、免疫抑制和严重的多系统损伤^[19]；此外，GyV3常与其他病毒混合感染，如同属的CIAV^[20]与GyG1（Gyrovirus galga 1）^[8]，造成更强的致病能力以及在免疫抑制上出现明显的协同效应，影响其他病原疫苗效果^[21]，给疾病的防控带来极大的困难。分子流行病学调查显示，2013–2017年患TVP的肉鸡中GyV3感染率为12.5%且GyV3在国内大部分省市均有流行^[7,22]。目前预防GyV3的手段只有通过流行病学监测，及时淘汰阳性鸡群，才能有效减少养殖企业的经济损失。因此，建立针对GyV3的快速诊断技术尤为重要。前人已采用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法对GyV3进行检测，但染料法扩增过程中非特异性扩增产物和引物二聚体可能与染料结合产生荧光信号导致假阳性，从而影响定量的准确性，相比之下，探针法特异性更高，更为可靠^[23-24]。

VP2基因是圆圈病毒的第二大开放阅读框，研究表明GyV3 VP2基因与同属于Group A分支的GyG1、环状病毒 6型（Gyrovirus 6，GyV6）等核苷酸序列相似性为76.1%～77.5%，与Group B、Group C分支的相似性更是低于60%，其基因遗传序列稳定、保守，常被用于流行病学监测^[6,25]，基于VP2基因建立的诊断方法不易与其他病毒发生交叉反应。本试验利用荧光定量PCR技术，根据GyV3 VP2基因的保守区域设计特异性引物和探针，建立了GyV3的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果显示，该方法最低检测限为1.585×10⁰ copies·μL⁻¹；对其他常见禽病原不发生非特异性反应；批内和批间变异系数均小于1%。综上所述，本研究建立的荧光定量检测方法灵敏性高、特异性强、稳定性好，适用于临床上早期诊断以及大规模检测，可为GyV3的流行病学调查及致病性研究提供技术支持。