0.   引言

【研究意义】猫尾草Uraria crinita （Linn.）desv.ex DC.是豆科蝶形花亚科狸尾豆属的多年生亚灌木植物，因花序形似动物尾巴而得名，在我国主要分布于广东、广西、福建等岭南地区，多野生于干燥旷野坡地、路旁或灌丛中^[1]。猫尾草全草皆可供药用，其根入药则又称石参，性微寒，味甘、淡，归肺、胃经，有散瘀止血、清热止咳之效，可以治疗外感风热，咳嗽痰多，儿童疳积、疟疾等疾病^[2]。在广东客家地区，石参被认为是上佳汤料，风味甘醇清香，长期食用可以壮腰健骨、缓解疲劳。此外，猫尾草根系发达，种植在沙地、石砾山地可以保护水土流失^[3]。因此，猫尾草具有较高的药用、食疗和经济价值。叶绿体基因组是研究遗传进化和系统分类的理想工具和新方向之一，探究叶绿体基因组的结构特征对植物品种鉴定、居群多样性、亲缘关系等方面均有促进意义。【前人研究进展】石参提取液可以降低II型糖尿病小鼠的空腹血糖、促进胰岛素分泌^[4]。石参总黄酮有较强的抗氧化作用，而且对胰岛细胞损伤具有保护作用^[5-6]。猫尾草资源原以野生采摘为主，随着市场需求日益增多，货源持续紧缺，现多地亦有栽培，但仍未能满足需求^[7]。与庞大复杂的核基因组相比，叶绿体基因组长度仅115～165 kb，且以多拷贝的形式存在，容易通过测序获得；叶绿体基因组基因构成保守，一般包含约130个基因，主要是与光合作用、叶绿体自身复制相关的基因，但基因间隔区等非编码区变异程度高，使得叶绿体基因组整体上具有适当的进化速率；叶绿体基因组结构稳定，通常为环状双链四段式结构，但同时拥有复制、转录和翻译机制，可以提供丰富的分类信息^[8-10]。随着细胞器基因组高通量测序及其序列解析技术的迅速发展，叶绿体基因组已广泛应用于药用植物的研究中。Cao等^[11]比较了紫花地丁和16种同属混伪品的叶绿体基因组序列，筛选出16个高突变区域，认为这些叶绿体序列是紫花地丁药材真伪鉴别的超级DNA条形码。宋芸等^[12]利用叶绿体基因组的18条简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）及其引物，分析15个产地共150份苦参种质的遗传多样性，将这些苦参种质分为具有明显地理相关性的2个类群，为苦参的品种选育和资源保护奠定基础。向如双等^[13]采用叶绿体基因组序列探讨腊肠树的发育进化位置，认为其与布鲁斯特决明的亲缘关系最近，应归至决明属，从基因组水平为决明属的植物分类提供了依据。【本研究切入点】目前，有关猫尾草的研究主要集中在药理药效、栽培技术等方面，而其基因组学、遗传进化、系统发育等领域的相关研究还有待深入进行。【拟解决的关键问题】本研究拟开展猫尾草的叶绿体基因组测序，阐明猫尾草叶绿体基因的结构和序列特征，明确猫尾草的进化关系，旨在为猫尾草的品种鉴别、遗传多样性、栽培育种和资源利用等提供叶绿体信息。

1.   材料与方法

1.1   植物样本

猫尾草收集于广西壮族自治区钦州市灵山县太平镇，将其新鲜叶片用纯水清洗并拭干，置于有硅胶的样品袋中保存备用。

1.2   DNA提取和测序

取约100 mg猫尾草叶片，采用磁珠法植物基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪公司）提取总DNA。质检合格后使用超声法随机打断，片段长度设定为350 bp，随后使用NexteraXT NDA 文库制备试剂盒（美国因美纳公司）进行末端修复和通用接头的连接，并构建用于测序的DNA文库。高通量测序由深圳惠通生物科技公司完成。

1.3   序列过滤、拼接和注释

使用NGS QC TOOLKit工具包滤去原始序列中不符合拼接要求的部分以及附加的通用接头，随后采用SPAdes软件对过滤后的序列进行拼接，PLANN软件进行基因注释。完成拼接和注释后，采用OGDRAW软件绘制猫尾草叶绿体基因组的结构图谱，并通过BankIt软件将序列提交至Genbank数据库（序列登记号为OQ885477）。

1.4   叶绿体基因组特征分析

运用CodonW软件计算猫尾草叶绿体基因组的相对同义密码子使用度（relative synonymous codon usage，RSCU），以评价猫尾草叶绿体基因组的密码子偏好性。RSCU值越大，密码子的使用频次越高，若RSCU大于1，则认为某密码子是使用偏好性密码子。通过MISA软件分析猫尾草叶绿体基因组 SSR的组成和分布情况。上述软件的参数设置均参照文献[14]。

1.5   叶绿体基因组比较分析

采用IRscope软件比较猫尾草、狸尾豆 Uraria lagopodioides、链荚豆 Alysicarpus vaginalis、蝙蝠草 Christia vespertilionis、单节假木豆Dendrolobium lanceolatum叶绿体基因组的单拷贝区-反向重复区边界差异，结果采用Adobe Illustrator软件进行美化。运用脚本将上述植物的叶绿体基因组注释文件转换成mVITSA软件所需要的注释文件，随后将叶绿体基因组序列及转换后的注释文件导入mVISTA软件，使用Shuffle-LAGAN模式，进行上述植物的叶绿体基因组序列差异分析。

1.6   系统进化分析

在Genbank的核苷酸数据库下载20余种与猫尾草相关物种的叶绿体基因组，并以单子叶植物梯牧草Phleum pretense为外类群，将所有供试叶绿体基因组序列导入MAFFT软件进行多重比对和校正，然后利用RAxML软件构建基于最大似然法（maximum likelihood，ML）的系统进化树，建树模型为GTRGAMMA，Bootstrap值为1 000，进化树采用MGEA软件进行可视化并使用Adobe Illustrator软件进行美化。

2.   结果与分析

2.1   叶绿体基因组结构和组成

如图1所示，猫尾草叶绿体基因组含有一对序列完全相同但转录方向相反的反向重复区（inverted repeat, IR）A和B，序列长度均为24 127 bp。 IRA和IRB把余下的序列划分成两个单拷贝区（single copy, SC），分别是83 072 bp的大单拷贝区（LSC）和18 448 bp的小单拷贝区（SSC），最终展现为149 774 bp的环状双链四段式分子。猫尾草叶绿体基因组整体GC含量为35.2%，共含有128个基因。

图  1  猫尾草叶绿体基因组

Figure  1.  Chloroplast genome of U. crinita

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通过基因注释和功能归类发现，在猫尾草叶绿体基因组的128个基因中，有83个是蛋白质编码基因，8个为rRNA基因，剩下的37个则是tRNA基因（表1）。在这些基因中，共17个基因含有内含子，其中 atpF、ndhA、ndhB、rpoC1、petB、petD、rps16、rpl2、rpl16、trnG-UCC、trnK-UUU、trnL-UAA、trnV-UAC、trnI-GAU、trnA-UGC基因各存在1个内含子，ycf3、clpP基因则各存在2个内含子。此外，有18个基因存在2个拷贝，其余则是单拷贝基因。

表  1  猫尾草叶绿体基因及其注释和功能归类

Table  1.  Composition and classification of genes in U. crinita chloroplast genome

分类 Category	功能 Function	基因 Gene
蛋白质编码基因 Protein-coding gene	ATP 合成酶 ATP synthase	atpA, atpB, atpE, atpF1, atpH, atpI
	细胞色素b/f复合物 Cytochrome b/f complex	petA, petB1, petD1, petG, petL, petN
	NADH脱氢酶 NADH dehydrogenase	ndhA1, ndhB1*, ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK
	光系统I Photosystem I	psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ
	光系统II Photosystem II	psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ
	核糖体蛋白质大亚基 Ribosomal proteins large submit	rps2, rps3, rps4, rps7*, rps8, rps11,rps12#*, rps14, rps15,rps161, rps18, rps19*
	核糖体蛋白质小亚基 Ribosomal proteins small submit	rpl21*, rpl14, rpl161, rpl20,rpl22*, rpl23*, rpl32,rpl33, rpl36
	RNA集合酶 RNA polymerase	rpoA, rpoB, rpoC11, rpoC2
	其他基因 Other genes	accD, ccsA, cemA, clpP2, matK, rbcL, infA
	假定叶绿体阅读框 Hypothetical chloroplast reading frame	ycf1, ycf2*, ycf32, ycf4
核糖体RNA Ribosomal RNAs		rrn4.5*, rrn5*, rrn16*, rrn23*
转运RNA Transfer RNAs		trnH-GUG, trnK-UUU1, trnM-CAU, trnM-CAU, trnV-UAC1, trnF-GAA, trnL-UAA1, trnT-UGU, trnS-GGA, trnfM-CAU, trnG-GCC, trnS-UGA, trnT-GGU, trnD-GUC, trnY-GUA, trnE-UUC, trnC-GCA, trnR-UCU, trnG-UCC1, trnS-GCU, trnQ-UUG, trnW-CCA, trnP-UGG, trnI-CAU, trnL-CAA*, trnV-GAC*, trnI-GAU1*, trnA-UGC1*, trnR-ACG*, trnN-GUU*, trnL-UAG
基因右上角的数字表示该基因所含的内含子数；#表示该基因存在反式剪接情况；*表示该基因为双拷贝基因。 Data on upper right corner stand for intron number in genes; # denotes trans-splicing in genes; * represents genes with two copies.

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2.2   密码子偏好性

猫尾草叶绿体基因组共有26 015个密码子，其中25 932个密码子编码氨基酸，余下的83个则是终止密码子。所有密码子的RSCU如图2所示，除了甲硫氨酸和色氨酸由单一的密码子编码外，其余18种氨基酸均存在2～6种同义密码子，且皆有1～3种密码子的RSCU大于1，表明在编码同一种氨基酸时，这些密码子的使用频率高于其他同义密码子。在终止密码子中，UAA的RSCU大于1，具有最高的使用次数。在30种RSCU大于1的密码子中，有29种的第三位碱基为A或T，表明猫尾草叶绿体基因组倾向以A或T结尾，与其低GC含量的情况相符。

图  2  猫尾草叶绿体基因组的相对同义密码子使用情况

Ala-丙氨酸; Arg-精氨酸; Asn-天冬酰胺; Asp-天冬氨酸; Cys-半胱氨酸; Glu-谷氨酸; Gln-谷氨酰胺; Gly-甘氨酸;His-组氨酸; Ile-异亮氨酸; Leu-亮氨酸; Lys-赖氨酸; Met-甲硫氨酸; Phe-苯丙氨酸; Pro-脯氨酸; Ser-丝氨酸; Thr-苏氨酸; Trp-色氨酸; Tyr-络氨酸; Val-缬氨酸; end-终止密码子。

Figure  2.  Relative synonymous codon usage of U. crinita chloroplast genome

Ala: alanine; Arg: arginine; Asn: asparagine; Asp: aspartate; Cys: cysteine; Glu: glutamate; Gln: glutamine; Gly: glycine; His: histidine; Ile: isoleucine; Leu: leucine; Lys: lysine; Met: methionine; Phe: phenylalanine; Pro: proline; Ser: serine; Thr: threonine; Trp: tryptophan; Tyr: tyrosine; Val: valine; end: ending codon.

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2.3   SSR分析

通过以拟定条件进行搜索，猫尾草叶绿体基因组共检索到110个SSR（表2），其中55个是单核苷酸SSR，占比最大；其次是二核苷酸SSR，有42个；随后是三、四核苷酸SSR，均为6个。没有检测到符合设定参数的五、六核苷酸SSR。在重复基序的组成上，以A/T碱基及其组合构成的SSR数量最多，达到105个，占全部SSR的95.5%。在SSR分布上来看，绝大多数SSR分布在单拷贝区，其中82个在LSC，22个在SSC，另各有3个分布在IRA和IRB。此外，77个SSR分布在基因间隔区，18个位于基因内含子中，剩下的15个位于基因内。由此可见，猫尾草叶绿体基因组含有类型比较丰富的、分布较为广泛的SSR，具有较高的多态性。

表  2  猫尾草叶绿体基因组SSR统计

Table  2.  SSR information on U. crinita chloroplast genome

类型 Type	重复基序 Motif	数量 Number	比例 Ratio/%
单核苷酸 Mononucleotide	A/T	54	98.2
	C/G	1	1.8
二核苷酸 Dinucleotide	AG/CT	1	2.4
	AT/AT	41	97.6
三核苷酸 Trinucleotide	AAT/ATT	6	100.0
四核苷酸 Tetranucleotide	AAAT/ATTT	4	57.1
	AAGG/CCTT	1	14.3
	AAGT/ACTT	1	14.3
	AGAT/ATCT	1	14.3
总计 Total		110

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2.4   SC/IR边界收缩扩张情况比较

在叶绿体基因组中，相邻的SC和IR之间两两形成边界，依次分别称为JLB、JSB、JSA和JLA，如图3所示。豆科蝶形亚科山蚂蝗族的5种植物叶绿体基因组介于149 656～150 186 bp，长度较为保守，且4个部分的长度也相差无几。5种植物的JLB均落在rps19基因内，相似度较高。5种植物的JSB则位于基因间隔区，其中猫尾草、狸尾豆和蝙蝠草的JSB在trnN和ndhF基因之间，且猫尾草和狸尾豆的JSB均在距离trnN基因745 bp和距离ndhF基因5 bp处；而链荚豆和单节假木豆的JSB落在ycf1和ndhF基因之间。所有植物的JSA均位于ycf1基因的另一拷贝内，其中猫尾草和狸尾豆JSB的位置完全一致。这些植物的JLA全部处于基因间隔区，猫尾草、狸尾豆和蝙蝠草的JLA在rpl2和trnH基因之间，而链荚豆和单节假木豆的JLA落在rps19基因的另一拷贝和ndhF基因之间。

图  3  5种植物的叶绿体基因组SC/IR边界的比较

Figure  3.  Comparison on boundaries of SC/IR in chloroplast genomes of 5 plants

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2.5   序列差异分析

豆科蝶形亚科山蚂蝗族的5种植物叶绿体基因组序列差异分析如图4所示，结果显示，5条序列整体上具有较高的相似度。SC的变异程度高于IR，且LSC的碱基突变位点比SSC多。非编码区的序列变异高于编码区，编码区大多数基因都较为保守，序列变异主要集中在ndhJ-trnF、trnL-trnT、psbD-rpoB、accD-cemA、ndhF-rpl32、rpl32-trnL等区域。在5种植物中，猫尾草与同属植物狸尾豆的序列同源性最高，差异碱基主要存在于非编码区，绝大多数基因的相似度均在90%以上。

图  4  豆科蝶形亚科山蚂蝗族5种植物叶绿体基因组序列差异分析

Figure  4.  Sequence differentiations among 5 chloroplast genomes from trib. Lespedezinae

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2.6   系统进化分析

基于叶绿体基因组构建的猫尾草系统进化树如图5所示，全部分支的自展支持率均达到100%，说明所构建的系统进化树可信度高。所有供试物种分为3个类群，分支I为豆科含羞草亚科的3个种以及云实亚科的3个种，两个亚科各自形成独立的小分支。分支II包括豆科蝶形亚科的12个种，其中又形成2个小分支，分支A为山蚂蟥族，由胡枝子亚族和山蚂蟥亚族组成，分别含有胡枝子属（Lespedeza）、鸡眼草属（Kummerowia）和假木豆属（Dendrolobium）、链荚豆属（Alysicarpus）、蝙蝠草属 （Christia）、狸尾豆属 （Uraria）；分支B则为野决明族，含有沙冬青属 （Ammopiptanthus）和野决明属（Thermopsis）。分支III由蔷薇科的3个种构成。在分支II中，猫尾草最先与同属的狸尾豆U. lagopodioides聚在一起，说明它们具有最近的亲缘关系。

图  5  基于叶绿体基因组构建的猫尾草系统进化树

Figure  5.  Phylogenetic tree of U. crinita based on chloroplast genome

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3.   讨论

本研究开展了猫尾草叶绿体基因组的高通量测序，获得猫尾草的第1条完整的猫尾草叶绿体基因组序列。结果发现，猫尾草叶绿体基因组在结构上含有1个LSC、1个SSC以及间隔在两者之间的2个IR，呈现为植物叶绿体基因组典型的环状双链四段式结构^[15-17]。猫尾草叶绿体基因组的全长为149 774 bp，GC含量为35.2%，与狸尾豆（149 828 bp，35.2%）、蝙蝠草（149 656 bp，35.2%）、短序算珠豆（Urariopsis brevissima，149 930 bp，35.2%）、假地豆（Desmodium heterocarpon，149 696 bp，35.2%）、长柄山蚂蟥（Hylodesmum podocarpum subsp. Podocarpum，149 564 bp，35.2%）、小槐花 （Ohwia caudata，150 249 bp，35.1%）、兴安胡枝子（Lespedeza davurica，149 010 bp，35.0%）、截叶铁扫帚（Lespedeza cuneata，149 010 bp，35.0%）等山蚂蟥族植物的叶绿体基因组长度和GC含量^[18-19]极为相似。猫尾草叶绿体基因组共注释到128个基因，其中蛋白质编码基因83个、rRNA基因8个、tRNA基因37个，其基因数量和组成与上述8种山蚂蟥族植物^[18-19]完全一致。说明叶绿体基因组在山蚂蟥族中具有显著的结构保守性。

在进化选择压力的作用下，植物会出现偏好在同义密码子中使用某一或几种特定的密码子来编码氨基酸的情况^[20]。因此，密码子偏好性是反映植物进化过程的指标之一。本研究发现，猫尾草叶绿体基因组含有64种共26 015个密码子，其中编码密码子61种25 932个。使用偏好性密码子（RSCU大于1）共30种，有29种是以A或T结尾的，说明猫尾草叶绿体基因组在进化过程中倾向使用以A或T结尾的密码子。前述8种山蚂蟥族植物的编码密码子数量介于25 809～26 021个，与猫尾草相近，而且这些植物叶绿体基因组的使用偏好性密码子也几乎都是以A或T结尾的^[18-19]，说明猫尾草与这些近缘植物具有一致的叶绿体基因组密码子偏好性，也与其他被子植物如高良姜^[21]、峨眉凤仙花^[22]等类似。

叶绿体基因组SSR可以为植物DNA分子标记开发提供数据，是研究居群遗传、进化发育关系的重要工具^[23]。研究发现，猫尾草叶绿体基因组含有数量较多、分布不匀的SSR。数量最多的是单核苷酸重复（55/110，50.0%），以A/T居多（54/55，98.2%）；其次是二核苷酸重复（42/110，38.2%），以AT/TA为主（41/42，97.6%）。相同的现象也出现在狸尾豆等8种近缘植物中，单核苷酸重复SSR占比在45.0%～54.9%，二核苷酸重复SSR占比在29.4%～40.6%，并且A/T和AT/TA各在同类SSR占绝大多数，占比均超过97.0%^[18-19]。由此推测，山蚂蟥族植物叶绿体基因组可能具有相同的SSR模式，即以A或T及其组合形成的单、二核苷酸重复SSR为优势重复基序。

本研究从SC/IR边界、全序列比对和系统进化等3个方面系统地探讨了猫尾草与其他植物叶绿体基因组的区别和联系以及猫尾草的进化地位，结果显示，猫尾草与同属狸尾豆的叶绿体基因组高度同源，序列相似性最高，但在非编码区以及少数几个基因仍然可见碱基变异，说明叶绿体基因组可以有效地鉴别猫尾草及其近缘植物。结合前人的研究^[18-19]，发现trnL-trnT、ndhF-rpl32、rpl32-trnL等区域在猫尾草等多种山蚂蟥族植物之间存在较明显的碱基差异，提示这些叶绿体序列可以用作山蚂蟥族物种鉴别的潜在DNA条形码。本研究的系统进化树的聚类效果良好，且与前人的研究^[18-19]一致，结果表明猫尾草与狸尾豆的亲缘关系最近，符合传统植物分类结果，清晰地反映了猫尾草的进化位置。此外，构建系统进化树所用的外类群植物梯牧草，是我国中西部常见的优质牧草，因其花序也与动物尾巴较为相似，在多地亦被称猫尾草^[24]。梯牧草为单子叶植物，猫尾草则是双子叶植物，两者亲缘关系较远，本研究的系统进化树佐证了这一事实，因此应当避免混淆。

本研究采用高通量测序技术结合生物信息学方法，首次报道岭南特色药食两用植物猫尾草的叶绿体基因组，并解析其结构特点和系统进化关系，从基因组水平为猫尾草的栽培育种、遗传多样性和资源利用奠定基础。