2023年 38卷 第8期
2023, 38(8): 889-893.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.001
摘要:
目的 获得特异性识别新型番鸭细小病毒（New-genotype muscovy duck Parvovirus ，N-MDPV）Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。 方法 通过蛋白序列分析，选取N-MDPV Rep羧基端亚片段区域487～627 aa，后全基因合成序列，并在其C末端添加His-tag标签，利用无缝克隆的方法，将该段基因克隆至pET-28a(+)载体，随后转化Rosetta（DE3）大肠杆菌，诱导表达得到重组蛋白。利用镍柱亲和层析技术纯化表达重组蛋白，将纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔，制备针对Rep蛋白羧基端亚片段的多克隆抗体。 结果 构建了pET-28a-Rep-487-627原核表达质粒，纯化表达了该重组蛋白。SDS-PAGE结果表明该重组蛋白分子大小约24 kDa，主要以可溶性形式表达。间接免疫荧光和免疫印迹试验表明制备的多克隆抗体能与细胞内过表达的N-MDPV Rep蛋白特异性反应。 结论 制备的Rep多克隆抗体具有良好反应特异性，可识别Rep蛋白的构象表位和线性表位，满足进一步研究的需要。
2023, 38(8): 894-900.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.002
摘要:
目的 克隆猪c-Myc基因CDS序列并构建其原核表达载体，同时纯化c-Myc蛋白并以此为抗原制备多克隆抗体，为进一步研究猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）Rep蛋白与宿主c-Myc蛋白之间的交互作用奠定基础。 方法 根据猪c-Myc全基因序列（GenBank No. NM_001005154）设计引物，以反转录PCR方法扩增c-Myc基因CDS序列，经Nde I/Xho I双酶切后定向克隆至原核表达载体pET-30a（+）；转化至Arctic-ExpressTM大肠杆菌后诱导表达；表达产物经变性、复性和His-Band Ni+层析柱亲和纯化后免疫新西兰白兔。抗原亲和层析法纯化抗体后，用间接ELISA法测定其效价，用Western blot检测其特异性。 结果 经检测，克隆产生的猪c-Myc基因CDS序列长度为1 359 bp，c-Myc-His重组蛋白主要以包涵体形式出现，分子质量约为63 kDa，由此蛋白制备的多抗效价可以达到1∶1 093 500，并能特异性识别猪c-Myc蛋白和重组蛋白c-Myc-His。 结论 本研究成功制备了猪c-Myc蛋白多克隆抗体，为研究猪c-Myc蛋白功能和其与PCV2 Rep蛋白之间的相互作用奠定了良好基础。
2023, 38(8): 901-909.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.003
摘要:
目的 对玉米（Zea mays L.）甘油-3-磷酸酰基转移酶（Glycerol-3-phosphate acyltransferase，GPAT）家族成员ZmGPAT13进行生物信息学分析和在不同非生物胁迫处理下的基因表达模式变化检测，为进一步研究ZmGPAT13的生物学功能奠定理论基础。 方法 通过TAIR和MaizeGDB数据库获得拟南芥（Arabidopsis thaliana）和玉米中GPAT家族蛋白序列，利用生物信息学方法进行理化性质、蛋白结构、亚细胞定位、保守基序、系统进化、磷酸化位点和启动子顺式作用元件等分析，并采用荧光定量PCR（qRT-PCR）技术对ZmGPAT13在不同组织部位及甘露醇（Mannitol）、NaCl、脱落酸（ABA）、高温（42 ℃）、低温（4 ℃）处理下的相对基因表达量进行分析。 结果 ZmGPAT13是一个定位于线粒体的跨膜蛋白，与部分GPAT家族成员含有排序相同的15个保守基序（motif），且与拟南芥中AtGPAT1的亲缘关系最近；预测分析发现ZmGPAT13含有62个磷酸化位点，可能与玉米中多个GPATs存在相互作用关系；ZmGPAT13基因启动子富含多种与低温和ABA响应等相关的顺式作用元件。通过qRT-PCR技术对ZmGPAT13组织表达模式分析发现ZmGPAT13的相对基因表达量在胚芽鞘（Coleoptile）中最高，根（Root）中次之，叶片（Leaf）中最低；甘露醇（Mannitol）、NaCl、脱落酸（ABA）及高温（42 ℃）和低温（4 ℃）处理均能诱导ZmGPAT13的基因表达显著上调。 结论 玉米中ZmGPAT13具有高度的进化保守性，可能通过转录水平的变化参与调控玉米对干旱、盐、高温和低温等非生物胁迫的响应过程。
2023, 38(8): 910-916.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.004
摘要:
目的 探究红蓝光质调控烟苗根系发育的机理。 方法 以烤烟品种翠碧1号为试材，采用水培试验，研究红蓝光对烟草幼苗根系生长、内源气体信号分子硫化氢（H2S）合成和积累的影响。 结果 处理7 d时，与对照白光处理相比，结果表明：（1）红光处理烟苗地上部和根系生物量显著增加，增幅分别为74.62%和15.64%，蓝光根系生物量降幅为7.00%；（2）红光处理烟苗根系H2S含量显著增加，增幅为61.72%，而蓝光处理显著降低；（3）红光处理烟苗根系脱巯基酶（DES）、半胱氨酸合成酶（CS）活性分别升高24.28%、25.61%；蓝光处理则分别降低32.10%、18.30%；（4）红光处理的H2S生物合成关键基因NtDES表达量为白光处理的8.8倍，蓝光处理仅为白光处理的13.82%。 结论 红光处理可通过增强H2S生物合成关键酶编码基因的表达提高烟苗根系H2S的含量，进而促进侧根的发生，而蓝光效应与红光相反。
2023, 38(8): 917-923.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.005
摘要:
目的 通过对果实质地差异明显的2个梨品种进行质地差异相关研究，旨在发现导致梨品种果实质地差异的关键因素，为优良梨品种的选育提供理论依据。 方法 以玉露香梨和大果水晶梨为试材，观察发育过程中果肉细胞超显微结构，测定果实的硬度、脆度值、细胞壁代谢相关酶的活性和相关基因的相对表达量，并进行相关性分析。 结果 ①果实生长发育过程中玉露香梨和大果水晶梨果实硬度逐渐下降，且花后60 d 2个梨品种脆度值逐渐下降，玉露香梨果实硬度和脆度值显著低于大果水晶梨。②在400×放大显微倍数下，幼果期玉露香梨果肉细胞比大果水晶梨的大；果实膨大期和成熟期，2个梨品种果肉细胞均明显增大，玉露香梨果肉细胞小于大果水晶梨；玉露香梨细胞断裂边缘整齐平滑，形成脆性断口，大果水晶梨断裂边缘粗糙而不整齐。③果实发育过程中玉露香梨果肉果胶甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）活性极显著低于大果水晶梨，而多聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，PG）活性和β-半乳糖苷酶（β- Galactosidase，β-Gal）活性极显著高于大果水晶梨。④果实发育过程中玉露香梨果肉PME基因、PG基因和β-Gal基因相对表达量极显著低于大果水晶梨的表达量。相关性分析表明，玉露香梨和大果水晶梨的硬度与β-Gal 基因相对表达量呈显著正相关，脆度值与PG 基因相对表达量呈显著正相关。 结论 随着果实生长发育，玉露香梨和大果水晶梨果实质地的差异不仅表现在果肉细胞超显微结构上，还与细胞壁代谢相关酶密切相关，PG基因和β-Gal 基因可能在玉露香梨和大果水晶梨质地变化中发挥关键作用。
2023, 38(8): 924-931.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.006
摘要:
目的 高通量测序获取金钱蒲（Acorus gramineus）7个不同组织转录组信息，为不同组织中类黄酮化学成分合成差异提供分子信息，进而在分子水平上研究金钱蒲不同组织内类黄酮化学成分合成差异。 方法 利用高通量测序技术平台完成金钱蒲7个不同部位的转录组测序，对unigenes进行功能注释，借助注释结果挖掘类黄酮生物合成通路，筛选通路中的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）并进行表达量分析。 结果 共获得高质量数据39.91～42.97 M，总碱基量为5.98～6.45 Gb，Q30碱基百分比大于94.05%，GC含量为47.81%～50.32%。18616条unigenes在GO数据库中获得62 506个注释，根据功能划分为细胞组分、分子功能及生物过程三大类，分别对应 6、14、21个亚类，大量基因分布在细胞解剖实体、连接、催化活性和细胞过程等亚类中。10124条unigenes 富集在 KEGG 数据库的5大类19个亚类中，从其中筛选出4条类黄酮生物合成途径，14个关键酶，63个差异表达酶基因。这些基因在金钱蒲7个组织中具有表达差异性，表明这些结构基因在类黄酮生物合成过程中于不同部位发挥作用。 结论 研究结果丰富了金钱蒲的遗传信息，也为进一步解析金钱蒲类黄酮生物合成基因功能提供参考依据。
2023, 38(8): 932-943.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.007
摘要:
目的 探究芍药属亚属间杂种（伊藤杂种）的茎叶药用价值。 方法 利用高效液相色谱-二极管阵列检测（HPLC-DAD）与高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱技术（HPLC-Q-TOF-MS）对16个伊藤杂种茎、叶的次生代谢物进行定性、定量分析，并对其总酚含量和体外抗氧化活性进行测定。 结果 在16个伊藤杂种茎叶中共检测到19种次生代谢物，分别属于单萜苷类（5种）、黄酮类（6种）、单宁类（4种）、酚类（4种）。16个伊藤杂种茎叶中的代谢物成分基本相同；除酚类外，叶中其他3类代谢物和总代谢物含量均显著高于茎。16个伊藤杂种叶的抗氧化能力均显著高于茎；5个品种叶中的芍药苷含量高于药典规定的最低标准（18 mg·g−1）。聚类分析结果显示，16个品种被聚为3类，其中第3类群包含2个品种，特点为叶中除单萜苷类含量中等外，各项指标均最高。 结论 伊藤杂种的茎叶具有潜在的药用价值，筛选出2个具有药用植物潜力的伊藤杂种Unique和Lollipop。
2023, 38(8): 944-952.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.008
摘要:
目的 验证国际植物新品种保护联盟（UPOV）发布的金鱼草品种特异性、一致性和稳定性（DUS）测试指南中数量性状在我国的适应性，为建立金鱼草种质数量性状的科学评价方法、研制适应我国生态气候的金鱼草DUS测试指南奠定基础。 方法 以UPOV发布的金鱼草新品种测试指南（TG/221/1）为标准，对40份金鱼草种质开展种植试验，对植株、叶、花等部位的13个主要数量性状进行数据采集，应用SPSS软件对采集数据进行变异程度、数量性状分级和主成分分析。 结果 11个指南性状与2个非指南性状种间变异系数为16.9%～65.9%，种内变异系数为5.3%～12.2%，符合指南性状的选择标准；通过最小显著差法得到13个性状的表达状态分级，可作为金鱼草种质鉴定和DUS指南研制的参考；通过主成分分析法得到4个重要因子并新增了2个指南分组性状。 结论 通过金鱼草种质数量性状数据分析，初步确定了各性状不同分级的数值范围，验证了UPOV指南在我国的适应性并对其中花序长度的分级数量进行优化，新增主茎长度和主茎一级分枝数量作为指南分组性状候选，为我国金鱼草指南的研制提供支持。
2023, 38(8): 953-959.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.009
摘要:
目的 在滇杨幼苗时期和开花前利用形态差异对雌雄株进行性别鉴定极为困难，因此亟需探明对其性别进行快速鉴定的分子标记方法。 方法 以滇杨雌雄各30株为材料，利用简单重复序列（SSR）筛选与滇杨性别相关的分子标记，并利用所获得的SSR标记对未知性别滇杨幼苗进行鉴定，分析滇杨苗期的性别分化情况。 结果 从已报道的相关文献中选出15对与植物性别连锁的SSR引物，经试验筛选出1对（BPCA90）在琼脂糖凝胶检测中显现清晰条带且反应稳定的SSR引物，并将这对引物经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行复筛，经PCR扩增后在滇杨雄株中出现1条特异性条带，大小在680 bp左右。利用这对SSR引物对30株滇杨幼苗进行性别鉴定，结果表明雄株明显多于雌株，且比例为13∶2。 结论 试验筛选所得到的SSR引物可以用于滇杨早期进行性别鉴定。研究结果可作为滇杨早期性别鉴定的遗传标记，为今后滇杨在生产中的分性别利用提供技术支持。
2023, 38(8): 960-965.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.010
摘要:
目的 明确6种杀虫剂对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的防效及对螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis的安全性。 方法 分别采用茎叶喷雾法测试甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（甲维盐）、乙基多杀菌素、虫螨腈、氯虫苯甲酰胺、虱螨脲和茚虫威对田间玉米草地贪夜蛾的防治效果，采用浸叶法测定以上6种杀虫剂对草地贪夜蛾2龄幼虫的室内毒力，以及试管药膜法研究以上6种杀虫剂对螟黄赤眼蜂的室内毒性。 结果 6种供试药剂对草地贪夜蛾的速效性和持效性均较好，药后1 d对草地贪夜蛾的田间防效达78.68%～95.75%；药后3 d对草地贪夜蛾的防效均达90%以上，药后7 d对草地贪夜蛾的防效仍达88.27%～96.3%。甲维盐、虫螨腈、乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺对螟黄赤眼蜂具有极强的毒力，其50%推荐剂量即可导致螟黄赤眼蜂全部死亡，预示着上述这些杀虫剂的田间应用对螟黄赤眼蜂具有很高的直接杀伤风险；茚虫威和虱螨脲对螟黄赤眼蜂的毒力均较低。 结论 综上，甲维盐、虫螨腈、乙基多杀菌素和氯虫苯甲酰胺可作为草地贪夜蛾应急防治的首选药剂，茚虫威和虱螨脲可作为草地贪夜蛾综合防控的推荐用药。
2023, 38(8): 966-975.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.011
摘要:
目的 优化山苍子精油提取工艺，探究精油抑菌活性，为山苍子精油的加工及应用提供参考数据。 方法 通过响应面法优化山苍子精油提取过程中NaCl体积分数、液料比、蒸馏时间的工艺条件。采用生长速率法探究山苍子精油对瓜果腐霉菌的抑制作用，通过测定精油对菌丝干重、丙二醛含量、还原糖含量、过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等保护酶活性的影响，探讨了其抑制植物病原真菌的生理生化作用。 结果 确定了最佳工艺条件：NaCl体积分数为2.39%，液料比[V（mL）∶m（g）]为4.8∶1，蒸馏时间4.94 h。在该条件下，精油得率可达4.43%。山苍子精油对瓜果腐霉具有较好抑制效果，EC50值为224.4 μg· mL−1。瓜果腐霉菌经山苍子精油处理后，菌丝干重减少，细胞膜通透性增加，菌体内还原糖含量减少，保护酶含量增多。 结论 经响应面优化后的工艺稳定可行，与其他的各类提取方法相比成本低消耗低与得率高。山苍子精油可以通过抑制菌丝生长、破坏细胞膜结构以及降低菌丝体保护酶活性等发挥抑菌活性。
2023, 38(8): 976-982.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.012
摘要:
目的 明确引起重庆市万州区海桐叶斑病的病原及其生物学特性，并筛选出有效防治药剂。 方法 采用组织分离法从具有典型症状的海桐叶片分离病原菌，进行致病性测定，采用形态学和分子生物学方法对病原菌进行鉴定，用菌丝生长速率法进行病原菌生物学特性和室内药剂筛选。 结果 从病叶中分离获得菌株HT10，将其回接于健康叶片上，接种后病斑中央呈灰褐色，边缘棕褐色，外围有黄色晕圈，与田间症状一致，符合柯赫氏法则的致病性测定；PDA培养基上菌丝呈棕黑色，分生孢子倒棒状、卵形或近椭圆形，表面具横隔和纵隔；经多基因（ITS、GAPDH和RPB2）系统发育分析，其与长柄链格孢（Alternaria longipes）聚集在同一分支；A. longipes最适生长条件为：PDA培养基，全光照，28 ℃和pH 6.0，碳源和氮源分别是蔗糖和甘氨酸，致死温度41 ℃ / 15 min。室内毒力测定结果表明，25%抑霉·咯菌腈悬乳剂抑菌作用最强，EC50为0.799 μg·mL−1，400 g·L−1克菌·戊唑醇悬乳剂抑菌作用最弱，EC50为370.457 μg·mL−1。 结论 海桐叶斑病的致病菌为长柄链格孢（A. longipes），这是A. longipes侵染海桐引起叶斑病的首次报道；25%抑霉·咯菌腈悬乳剂对A. longipes有较强的抑制作用。
2023, 38(8): 983-988.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.013
摘要:
目的 建立基于SYBR Green I嵌合染料法的灌溉水源中沙门氏菌实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）检测方法。 方法 以沙门氏菌侵袭蛋白A （invA）基因为靶基因，设计1对特异性qPCR检测引物，在对qPCR反应体系和反应条件进行优化后，通过特异性实验和灵敏度实验对qPCR方法进行验证，并制作灌溉水源中沙门氏菌qPCR定量标准曲线，最后与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染来验证该方法的准确性。 结果 经过优化的qPCR检测方法灵敏度检测结果显示最低检测限量为1×10−1 pg·μL−1，特异性检测结果显示具有良好的特异性，干扰菌株对本qPCR检测方法无影响，所制作的qPCR扩增标准曲线在2×100～2×105 cfu·mL−1有较好的线性关系，相关系数为0.999 6，能对沙门氏菌进行准确的定量分析。该方法在与国标方法对比检测灌溉水源中沙门氏菌污染时具有同等准确性。 结论 本研究建立的基于SYBR Green I嵌合荧光法的实时荧光定量PCR检测方法，可以满足灌溉水源中沙门氏菌的定量检测要求。
2023, 38(8): 989-1003.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.014
摘要:
目的 研究并建立运用ITS基因条码技术针对保健食品常见植物原料源性成分的分子生物学鉴定技术。 方法 通过采用回顾性调查方法，选取西洋参（Panax quinquefolius）、铁皮石斛（Dendrobium candidum）以及红景天（Rhodiola nobilis）、枸杞子（Lycium barbarum L.）与人参Ginseng（Radix Ginseng）作为研究对象。探索其作为生产原料的常见保健食品剂型中，目标 DNA 的最佳提取方法。运用ITS2内转录间隔区保守特性设计引物序列，并通过调整优化体系中各物质的组分，由此构建稳定高效准确的PCR反应体系。 结果 采用改良CTAB法可实现对所研究的保健食品中常见剂型目标DNA的提取，纯度及质量达到反应要求。所建立的PCR法扩增效果良好，对西洋参、铁皮石斛以及红景天的方法灵敏度均为1 ng·μL−1，枸杞子与人参的方法灵敏度为0.1 ng·μL−1。 结论 运用建立的方法可实现对保健食品中常见植物性原料西洋参、人参、铁皮石斛、枸杞子、红景天成分的鉴定，适用于丸剂、片剂、口服液等不同剂型的保健食品中原料鉴别，可运用于对保健食品中植物源性的检测。
2023, 38(8): 1004-1010.
doi: 10.19303/j.issn.1008-0384.2023.08.015
摘要:
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus virus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）以及其他猪相关疾病的主要病原体。复制酶（Replicase，Rep）蛋白是由PCV2 ORF1基因编码的功能性复制启动蛋白，通过与ORF1编码的另一复制相关蛋白Rep′共同作用参与PCV2的DNA滚环复制。Rep蛋白作为PCV2的一种必需功能性蛋白，是研究PCV2抗病毒治疗的一个新突破口。然而，目前有关PCV2致病机理及疫苗的研究大多集中在Cap蛋白，对于Rep蛋白的作用机制研究较少。因此，本文结合国内外近年研究进展，对PCV2 Rep蛋白的胞内互作蛋白进行了系统分析，尤其对现今已发现的8种胞内互作蛋白在PCV2复制过程中可能发挥的重要作用及机制进行了阐释，并对其他可能与PCV2 Rep蛋白存在相互作用的胞内蛋白进行预测，以期为进一步阐明Rep蛋白在PCV2致病中的作用提供理论依据。
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus virus type 2，PCV2）是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）以及其他猪相关疾病的主要病原体。复制酶（Replicase，Rep）蛋白是由PCV2 ORF1基因编码的功能性复制启动蛋白，通过与ORF1编码的另一复制相关蛋白Rep′共同作用参与PCV2的DNA滚环复制。Rep蛋白作为PCV2的一种必需功能性蛋白，是研究PCV2抗病毒治疗的一个新突破口。然而，目前有关PCV2致病机理及疫苗的研究大多集中在Cap蛋白，对于Rep蛋白的作用机制研究较少。因此，本文结合国内外近年研究进展，对PCV2 Rep蛋白的胞内互作蛋白进行了系统分析，尤其对现今已发现的8种胞内互作蛋白在PCV2复制过程中可能发挥的重要作用及机制进行了阐释，并对其他可能与PCV2 Rep蛋白存在相互作用的胞内蛋白进行预测，以期为进一步阐明Rep蛋白在PCV2致病中的作用提供理论依据。
